[发明专利]一种提高梭菌中蛋白表达效率的方法

权利要求书

1.一种提高梭菌中蛋白表达效率的方法，其特征在于，将目标蛋白与核苷酸序列如SEQID NO.1所示的非经典分泌蛋白融合，在梭菌中进行蛋白表达；其中，所述的梭菌为丙酮丁醇梭菌，其保藏编号为CGMCC No.5234。

2.根据权利要求1所述的提高梭菌中蛋白表达效率的方法，其特征在于，所述的目标蛋白为绿色荧光蛋白。

3.根据权利要求2所述的提高梭菌中蛋白表达效率的方法，其特征在于，将绿色荧光蛋白优化后再与非经典分泌蛋白进行融合表达；其中，优化后的绿色荧光蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

4.根据权利要求1所述的提高梭菌中蛋白表达效率的方法，其特征在于，所述的融合表达为将非经典分泌蛋白融合于目的蛋白的N端或C端。

5.根据权利要求1所述的提高梭菌中蛋白表达效率的方法，其特征在于，将绿色荧光蛋白与核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的非经典分泌蛋白融合，在丙酮丁醇梭菌中表达，得到重组丙酮丁醇梭菌。

6.根据权利要求5所述的提高梭菌中蛋白表达效率的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将绿色荧光蛋白优化后克隆至pSY8质粒载体，构建到pSY8-GFP质粒；

(2)以从丙酮丁醇梭菌中提取的DNA为模板，进行PCR扩增，得到非经典分泌蛋白N端或C端融合片段的基因序列；

(3)以步骤(1)构建的pSY8-GFP质粒为模板，进行PCR扩增，得到绿色荧光蛋白的基因序列；

(4)将步骤(2)和步骤(3)得到的基因序列重叠PCR，得到非经典分泌蛋白-N/C-绿色荧光蛋白的融合片段；

(5)将步骤(4)得到的融合片段纯化后与经Nde I酶切线性化的载体片段连接，并转化至第一大肠杆菌中以扩增质粒，再转化至第二大肠杆菌甲基化；

(6)将步骤(5)构建的甲基化后重组表达质粒电击转化至丙酮丁醇梭菌，即构建得到重组丙酮丁醇梭菌。

7.根据权利要求6所述的提高梭菌中蛋白表达效率的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的pSY8质粒载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

8.根据权利要求6所述的提高梭菌中蛋白表达效率的方法，其特征在于，步骤(5)中，所述的第一大肠杆菌为E.coli DH5α；所述的第二大肠杆菌为E.coli Top10。