[发明专利]一种特立帕肽的纯化方法

说明书

本发明公开了一种特立帕肽的纯化方法。包括如下步骤：(1)以磷酸盐缓冲液为流动相A1，以乙腈为流动相B对特立帕肽粗肽溶液进行梯度洗脱，收集洗脱组分；(2)将步骤(1)收集的洗脱组分以碳酸盐缓冲溶液为流动相A2，以乙腈为流动相B进行冲洗，置换所述洗脱组分中的磷酸盐；(3)转盐：以醋酸溶液为流动相A3，以乙腈为流动相B进行梯度洗脱，收集洗脱组分得醋酸特立帕肽。本发明通过一步纯化即可将单个杂质控制0.10％以内，避免多次纯化而导致有机溶剂消耗量过大，减少纯化的步骤及废液的排放，整个过程操作简单，生产周期短，环境友好，有利于大规模工业化生产。

技术领域

本发明涉及多肽纯化技术领域，尤其涉及一种特立帕肽的纯化方法。

背景技术

特立帕肽(Teriparatide)由美国礼来公司开发，是含有84个氨基酸的内源性甲状旁腺素(PTH)具有生物活性的N-末端区域的1-34氨基酸片段(PTH1-34)，分子式为C₁₈₁H₂₉₁N₅₅O₅₁S₂，分子量4177.77。美国食品药品监督管理局于2002年11月26日批准了特立帕肽用于治疗男人和绝经期妇女的具有高度骨折风险的骨质疏松症，也用于治疗男人的原发和或由于性机能减退造成的具有高骨折风险的骨质疏松。特立帕肽是第一种获得美国食品及药物管理局FDA批准的骨形成剂类新药。目前的常规骨质疏松药物一般只是作用于破骨细胞而减缓或阻断骨质流失，而特立帕肽这种甲状旁腺激素的衍生物有增加成骨细胞数目、增强其活性及阻止成骨细胞凋亡的作用。因其可增加成骨细胞的活性及数量，从而可以促进骨生长，用于严重骨质疏松的二线治疗。此外特立帕肽副作用很小，通常只是恶心、眩晕和腿痛性痉挛。因此特立帕肽具有很高的药用价值和广阔的市场前景。其肽序为：

H-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe-OH。

通过固相合成的特立帕肽具有较多的消旋杂质，且因为肽链较长，消旋杂质与主成分的分离难度大，所以在纯化的过程中需要通过多步纯化才能够将杂质降低至可接受的水平，这导致纯化的周期长，样品的损失大。

如：CN 101798334 B中，使用一步纯化加一步转盐得到醋酸特立帕肽，使用十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以0.05％～0.2％的三氟乙酸水溶液为A相，乙腈为B相，梯度：B％：20％～40％，将粗肽溶液进行梯度洗脱；而后采用反相高效液相色谱法将人甲状旁腺激素(1-34)的三氟乙酸盐转成醋酸盐。该法所得的特立帕肽纯度为98％，未对消旋杂质进行控制。

CN 102993293 A中，以体积比0.1％～0.4％的硫酸和体积比0.1％～0.4％醋酸水溶液用氨水调pH值5.0～6.0后的溶液为A相，乙腈为B相进行纯化；而后将合格馏分进行盐析；用含3％～10％乙腈的醋酸铵溶液冲洗，用十八烷基硅烷键合硅胶高效液相色谱进行转盐，醋酸水溶液乙腈体系洗脱。在盐析之后使用50％～100％的磷酸水溶液将其溶解后，如此高浓度的磷酸无法进行下一步的转盐，必须用碱中和，中和的过程会出现较多的降解杂质，且溶解的过程会有较大的损失。

CN 106167522 A中，使用醋酸铵进行纯化，而后转为醋酸盐，该方法仅控制纯度为＞99.0％，未对消旋杂质进行控制。

CN 108373499 A中，第一步将粗肽溶液使用碳酸氢铵水溶液的乙腈体系进行第一次纯化；第二步将上述收集的洗脱液使用硫酸钠/硫酸的乙腈体系进行第二次纯化；第三部将收集的洗脱液先用醋酸铵水溶液乙腈体系洗脱，再用醋酸水溶液乙腈体系洗脱进行高效液相转盐；第四步将转盐后的洗脱液减压浓缩后加入盐酸。该方法通过多次纯化，且使用不同的色谱系统，步骤繁琐，纯化的乙腈消耗量大，不利于环保。

发明内容