[发明专利]用于检测肿瘤细胞内microRNA-203的双光子荧光纳米探针及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种用于检测肿瘤细胞内microRNA‑203的双光子荧光纳米探针及其制备方法和应用，所述双光子荧光纳米探针包括双光子硅纳米颗粒、羧基荧光素和发夹结构DNA，所述双光子硅纳米颗粒上修饰了发夹DNA1，发夹DNA2上修饰了所述羧基荧光素，所述双光子硅纳米颗粒作为能量供体，所述羧基荧光素作为荧光受体。本发明通过合成一种核酸功能化的双光子硅纳米探针，联合催化发夹自组装(CHA)信号放大策略和荧光共振能量转移(FRET)的方法可以实现对细胞中microRNA‑203的成像和检测。

技术领域

本发明涉及纳米材料与生物传感器技术领域，尤其涉及一种用于检测肿瘤细胞内microRNA-203的双光子荧光纳米探针及其制备方法和应用。

背景技术

MicroRNA作为一种短链、非编码、内源性RNA，不仅广泛的参与早期发育、细胞增殖、分化、凋亡等多种生物过程的调控，同时其表达水平与各种疾病密切相关，因此microRNA可以做研究许多疾病的重要标志物。特别的是，microRNA的异常表达(上调或下调)与癌症的发生发展密切相关，被认为是不同癌症预后、诊断和治疗过程中有前景的生物标志物。由于细胞内microRNA的含量普遍较低，因此人们致力于发展能够特异性、高灵敏的检测microRNA的方法。现有技术中，反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)是一种传统的检测低浓度RNA信号放大策略，但是其只能够在缓冲液中操作，无法反映在细胞中表达的差异；基于等温酶信号放大的原位杂交(FISH)策略，由于酶向内运输需要细胞的固定，只能够实现对单细胞的microRNA成像，不适宜用于活细胞成像。最近几年，基于无酶信号放大目标物，实现对活细胞中低浓度microRNA的检测与成像成为人们关注的重点。催化发夹组装(CHA)是一种能够很好实现原位痕量目标物的信号放大策略，其有望实现对细胞中原位microRNA的荧光成像。

荧光成像作为一种目前常用的可视化、动态监测活细胞变化的技术，已经被广泛的应用在生物医学研究和分子诊断。传统的荧光成像手段容易受到生物背景自身荧光的干扰，以及外部环境的干扰，而荧光共振能量转移(FRET)作为一种比率性荧光成像的手段能够很好消除背景信号的干扰，且不受外界因素的干扰，实现对细胞内物质的精准定量。同时传统的荧光成像手段组织成像穿透深度低，无法实现较大组织穿透深度的成像，而具有更深组织穿透深度、更低荧光背景、高时空分辨的双光子成像能够很好地避免上述问题。将FRET和双光子成像结合不仅能够减少生物自发荧光背景干扰，同时能够获得较大组织穿透深度的信息，实现对生物样品的无损、高灵敏精准定量。

基于上述的研究背景，如能构建了一种基于触发性CHA信号放大和FRET策略的核酸功能化双光子硅纳米复合探针，就有望用于监测活细胞内源性microRNAs的表达，对于组织成像和活体成像技术的发展具有重要意义。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是构建一种能够精准定量不同肿瘤细胞中痕量microRNA-203的荧光探针，联合催化发夹自组装(CHA)信号放大策略和荧光共振能量转移(FRET)的方法实现对细胞中microRNA-203的成像和检测。

为解决上述技术问题，本发明第一方面提供一种用于检测肿瘤细胞内microRNA-203的双光子荧光纳米探针，包括双光子硅纳米颗粒、羧基荧光素和发夹结构DNA，所述双光子硅纳米颗粒上修饰了发夹DNA1，发夹DNA2上修饰了所述羧基荧光素，所述双光子硅纳米颗粒作为能量供体，所述羧基荧光素作为荧光受体。

进一步地，所述发夹DNA1的序列为：5'-TTT AGG ACC ACT AGG GTG TGT GTG GGCTAG TGG TCC TAAACATTTCAC-NH₂-3'，所述发夹DNA2的序列为：5'-GGT GTG TGT GGG(T-FAM)TTA GGACCACTAGCC CAC ACA CAC CCT AGT GGT-3'。

本发明第二方面提供一种上述的用于检测肿瘤细胞内microRNA-203的双光子荧光纳米探针的制备方法，包括以下步骤：