[发明专利]用于检测肿瘤细胞内microRNA-203的双光子荧光纳米探针及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种用于检测肿瘤细胞内microRNA-203的双光子荧光纳米探针，其特征在于，包括双光子硅纳米颗粒、羧基荧光素和发夹结构DNA，所述双光子硅纳米颗粒上修饰了发夹DNA1，发夹DNA2上修饰了所述羧基荧光素，所述双光子硅纳米颗粒作为能量供体，所述羧基荧光素作为荧光受体。

2.根据权利要求1所述的用于检测肿瘤细胞内microRNA-203的双光子荧光纳米探针，其特征在于，所述发夹DNA1的序列为：5'-TTT AGG ACC ACT AGG GTG TGT GTG GGC TAGTGG TCC TAAACATTTCAC-NH₂-3'，所述发夹DNA2的序列为：5'-GGT GTG TGT GGG(T-FAM)TTAGGACCACTAGCC CAC ACA CAC CCT AGT GGT-3'。

3.一种如权利要求1或2所述的用于检测肿瘤细胞内microRNA-203的双光子荧光纳米探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、合成双光子硅纳米颗粒TP-SiNPs；

S2、发夹DNA1修饰双光子硅纳米颗粒制备TP-SiNPs@H₁；

S3、在发夹DNA2上修饰羧基荧光素FAM，得到H₂-FAM。

4.根据权利要求3所述的用于检测肿瘤细胞内microRNA-203的双光子荧光纳米探针的制备方法，其特征在于，所述步骤S1具体包括：

S11、将2-萘甲酸添加到的含有DIPEA和HATU的DMF中，在冰浴中反应0.5-1.5小时，加入APTES并在室温下搅拌1-2小时；

S12、将步骤S11得到的混合物倒入冰水中，产生沉淀，沉淀经真空过滤机分离，硅胶柱层析纯化，得到固体粗产物；

S13、将TEOS溶解在乙醇中，逐滴加入步骤S12得到的固体粗产物中，再滴加三乙醇胺，搅拌反应1-2小时，离心收集反应物并用乙醇洗涤数次；

S14、将步骤S13得到的反应物溶解在乙醇中，加入戊二酸酐，搅拌3-5小时，离心并洗去未反应的戊二酸酐，冷冻干燥得到双光子硅纳米颗粒TP-SiNPs。

5.根据权利要求3所述的用于检测肿瘤细胞内microRNA-203的双光子荧光纳米探针的制备方法，其特征在于，所述步骤S2具体包括：

S21、将EDC和sulfo-NHS添加到含有双光子硅纳米颗粒TP-SiNPs的MES缓冲液，反应8-12小时，超滤离心除去过量的EDC和sulfo-NHS，得到羧基活化的TP-SiNPs；

S22、将羧基活化的TP-SiNPs分散在HEPES缓冲液中，并与发夹DNA1溶液混合，在3-7℃下反应40-56小时；

S23、用Tris缓冲液超滤离心清洗数次，得到发夹DNA1修饰双光子硅纳米颗粒TP-SiNPs@H₁。

6.根据权利要求3所述的用于检测肿瘤细胞内microRNA-203的双光子荧光纳米探针的制备方法，其特征在于，所述步骤S3具体包括：

得到发夹DNA2后，将C6-dT amino-linker加到胸腺嘧啶残基上，修饰后氨基与主链相距10个原子，通过有机合成的方法将羧基荧光素FAM标记在发夹DNA2的序列上，得到H₂-FAM。

7.根据权利要求3所述的用于检测肿瘤细胞内microRNA-203的双光子荧光纳米探针的制备方法，其特征在于，发夹DNA1和发夹DNA2通过亚磷酰胺三酯法合成，合成的方向为：待合成引物的3’端向5’端合成，相邻的核苷酸通过3’-5’磷酸二酯键连接。

8.如权利要求1或2所述的用于检测肿瘤细胞内microRNA-203的双光子荧光纳米探针在组织成像/活体成像中的应用。