[发明专利]一种光控荧光探针及其制备方法和应用

说明书

本发明属于核酸/纳米粒子/荧光探针技术领域，具体公开了一种光控荧光探针及其制备方法和应用。该荧光探针为一条DNA双链和贵金属纳米颗粒结合而成；是一种灵敏度高、生物相容性好的基于双标记的DNA和纳米金的荧光探针，实现高效灵敏的对细胞内温度的监测。

技术领域

本发明属于核酸/纳米粒子/荧光探针技术领域，涉及一种光控荧光探针及其制备方法以及在细胞温度成像方面的应用。

背景技术

温度是可以监测细胞内生理活动的基本物理常量，生理活动又与细胞内特定部位(如细胞器)的内源性或者外源性产生的细胞功能息息相关。因此，活细胞内的温度分布可以反映细胞内成分的热动力学性质和功能。同时医学研究表明疾病的细胞病变可表现为超常的热产生，所以对活细胞内温度分布的监测可以促进对细胞内活动更好的了解，以及建立新的诊疗方法。

荧光信号易于收集及量化，广泛应用于温度探针。DNA因其折叠和伸展与温度相关，同时稳定性好且易于编程，因此在细胞内的温度探针开发中有很大应用。纳米金生物相容性好，且具有保护负载其上的核酸免受酶切的特性，是很好的核酸载体。然而虽然纳米金对核酸链有保护作用，但也会干扰其灵敏度，另外温度探针主要以单荧光为主，很容易产生假信号，对获取真实的细胞温度分布情况造成干扰，因此需要设计新的温度探针来实现对细胞内温度的监测。

发明内容

本发明的首要目的是克服现有的不足，一是为了克服纳米金对灵敏度的干扰，加入了光控开关，以实现纳米金负载核酸进入细胞之后再进行光照，从而使温度探针得以释放，使其免受纳米金影响，提高灵敏度；二是为了克服假信号的产生，采用双荧光标记，通过两种荧光的比值对温度进行成像，以期获得更准确的信息。基于以上设计了一种灵敏度高、生物相容性好的基于双标记的DNA和纳米金的荧光探针，实现高效灵敏的对细胞内温度的监测。

一种光控荧光探针，该荧光探针为一条DNA双链和贵金属纳米颗粒结合而成，DNA双链其中一条单链5’端修饰有巯基，中间修饰有光控开关，记为A链；另一条单链5’端修饰荧光受体基团，3’端修饰荧光给体基团，记为B链；A链在35-50℃下能与B链稳定结合；紫外光照断裂后，能与B链迅速分离；B链分成三部分：a,b,a’；B链能形成发卡结构，其中a和a’为发卡的茎部，b为发卡的环部；B链在35-50℃内，随温度在发卡结构和展开结构之间发生变化，温度升高，发卡结构比例变小，导致荧光FRET值降低。

A链5’端修饰有巯基是为了结合贵金属纳米颗粒，可以通过常规方法连接，如优选：巯基通过10个T碱基与A链5’端结合。

A链需满足：在生理温度35-50℃下能与B链稳定结合，因此，AB链Tm值需要满足Tm50℃。

同时A链受紫外光照断裂后，能与B链迅速分离，断裂后的每部分与B链的Tm值需要满足Tm15℃。。

B链需满足Tm值在30-50℃范围(在该温度范围内，比例随温度变化幅度大，进而导致灵敏度高)，该温度依据a和a’为发卡的茎部解链温度设定。

所述的光控荧光探针，A链优选20-23个碱基，B链优选21-29个碱基，其中a和a’优选5-7个碱基，b优选11-15个碱基。

所述的光控荧光探针，光控开关至少设置两个，优选第一个修饰在A链第6-9个碱基中间任意两个碱基之间，第二个修饰在A链的第13-16个碱基中间任意两个碱基之间。

所述的光控荧光探针，荧光给体包括FRET给体：cy3或FAM；荧光受体包括FRET受体：cy5或TAMRA。

所述的光控荧光探针，贵金属纳米颗粒为金纳米颗粒。

所述的光控荧光探针，金纳米颗粒的直径为12-15nm。

优选的，本发明所述的纳米金颗粒的合成包括以下步骤：

步骤(1)、首先配制1％的柠檬酸钠溶液；