[发明专利]一种抗体的纯化方法

说明书

本发明提供一种抗体的纯化方法，包括细胞发酵液沉淀、复合模式层析以捕获抗体、以及再次层析分离抗体以对抗体进行精细纯化的步骤，解决了目前ProteinA亲和层析的制备单克隆抗体成本高、样品中含有Protein A蛋白分子残留、非proteinA方法制备抗体纯度差等缺陷，具有操作简单、纯化效率高、样品损失少和纯化出的抗体纯度高、可以用于工艺的放大的优点。

技术领域

本发明涉及蛋白纯化技术领域，尤其是涉及一种抗体的纯化方法。

背景技术

目前，抗体药物的制备过程一般使用的ProteinA亲和填料做为第一步目标单克隆抗体的捕获方法，它是将ProteinA蛋白分子通过化学键偶联的方式连接到固定的基架上面，在含有目标抗体的发酵液经过填料时，单克隆抗体分子与ProteinA蛋白分子发生特异性结合，从而将发酵液中的抗体分子捕获，在通过一定的洗脱方式(一般为酸性洗脱方式)减弱抗体与ProteinA分子的结合力，从而将目的抗体洗脱下来，ProteinA亲和层析捕获抗体具体特异性强、纯度高、载量高、回收率高等优点。但是ProteinA亲和层析填料的制备过程复杂，填料的价格较高，而且有引入外源性蛋白的风险，给单克隆抗体的商业化制备带来了很大的挑战，开发一种非ProteinA亲和层析单克隆抗体的制备方法，成为行业发展的一种要求和趋势。

发明内容

本发明提供的抗体纯化方法，具有操作简单、纯化效率高、样品损失少和纯化出的抗体纯度高、可以用于工艺的放大的优点。

为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：

本发明提供了一种纯化抗体的方法，包括以下步骤：

a)细胞发酵液沉淀；

b)复合模式层析以捕获抗体；

c)再次层析分离抗体以对抗体进行精细纯化；

其中，步骤a)中的发酵液以酸性溶液调节发酵pH至设定值，静置30-60分钟后离心获得含抗体粗品的上清液，所得发酵液电导率不超过20mS/cm；将步骤(a)中获得的发酵液加载到步骤b)的预处理好的复合模式层析填料上，用平衡缓冲液清洗复合模式层析填料、用洗脱缓冲液洗脱并收集洗脱液；步骤c)中再次层析分离抗体的方式包括亲和层析、疏水层析或阳离子交换层析中的至少一种。

进一步，本发明的步骤a)的调节pH的酸性溶液包括冰乙酸、盐酸、柠檬酸中的至少一种，优选柠檬酸。

进一步，本发明的步骤a)的调节pH的酸性溶液的浓度为2mol/L。

进一步，本发明的调节发酵pH至4-5，优选4.5±0.2。

进一步，本发明的步骤a)的静置时间为45分钟。

进一步，本发明的步骤b)复合模式层析填料为Capto MMC。

进一步，本发明的步骤b)的平衡缓冲液含有浓度为50mmol/L的NaAC-HAC溶液，pH为4.5-5.5，优选PH为5.5；

洗脱缓冲液含有浓度为200mmol/L的Tris-HCl和浓度为1mol/L的NaCl溶液，pH为8.0。

进一步，本发明的步骤c)中再次层析分离抗体的方式为疏水层析和阳离子交换层析两步法。

进一步，本发明所述疏水层析填料为Phenyl，阳离子交换层析填料为SPFF；

进一步，本发明所述Phenyl疏水层析时的平衡缓冲液含有浓度为20mmol/L的PB和浓度为1.1mol/L的(NH)₄SO₄溶液，pH为7.0，

洗脱缓冲液含有浓度为20mmol/L的PB溶液，pH为7.0；