[发明专利]一种抗FLT3嵌合抗原受体修饰的T细胞及其在制备治疗AML药物中的应用

说明书

本发明提供一种抗FLT3嵌合抗原受体修饰的T细胞，将表达抗FLT3嵌合抗原受体的基因片段插入载体获得重组表达载体,采用慢病毒包装后感染活化的T细胞，得到抗FLT3嵌合抗原受体修饰的T细胞；所述嵌合抗原受体包括单链抗体scFv‑FLT3；所述单链抗体的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO.3所示；本发明还提供上述嵌合抗原受体修饰的T细胞在制备治疗AML药物中的应用。在效靶比为10:1时，本发明制备的CAR‑AntiFLT3‑T细胞对FLT3+HL‑60细胞的杀伤效率为95.67%，本发明设计的CAR‑AntiFLT3细胞活性受利妥昔单抗的控制，极大的提高CAR技术的临床安全性。

技术领域

本发明涉及一种抗FLT3嵌合抗原受体修饰的T细胞及其在制备治疗AML药物中的应用，属于生物医药技术领域。

背景技术

近年来，CAR-T细胞在B细胞恶性血液系统肿瘤治疗中取得了惊人的突破。例如，在临床应用中，CAR-T细胞对CD19阳性的难治复发白血病细胞的靶向杀伤作用及高缓解率（80~90%）的临床疗效。这一事实不仅证实了免疫细胞治疗的临床价值，同时也激发了学者对于肿瘤相关抗原和CAR-T细胞技术的拓展热情。

急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia，AML)是最常见的白血病类型之一，且难以治愈，5年生存率小于33%。急性髓系白血病的治疗首先是进行诱导缓解化学药物治疗，获得缓解后再进行巩固和强化治疗，待患者身体状态良好时进行干细胞移植，可辅助放射治疗，多数患者需长期间歇性治疗，该病愈后一般，多数患者不能治愈。

FLT3属于III型受体酪氨酸激酶家族，FLT3编码1000个氨基酸的蛋白质，其结构由胞外区、跨膜区和胞内区3部分组成。胞内区含有一个近膜（JM）结构、2个激酶区，中间被一个插入结构将酪氨酸激酶分割开，最后一个是C端终点结构。跨膜区有不连续的激酶作用的位点，胞内区为酪氨酸激酶催化区。据报道，在正常人骨髓中，FLT3仅表达于CD34+干/祖细胞，在红细胞系及成熟T、B淋巴细胞和NK细胞中无法表达。研究表明，野生型FLT3基因在AML中普遍高表达70%～100%。因此，FLT3作为一种AML的标志物，可以用来靶向治疗急性髓系白血病。

FLT3标志物的发现，给CAR-T细胞治疗AML提供了一种新的思路。

目前针对AML的治疗主要为化疗、放疗和干细胞移植，利用CAR-FLT3治疗AML最接近的现有技术为WO2019025484A1。该专利中利用FLT3 鼠源的4G8和BV10抗体序列构建合成的CAR，且CAR结构仅为二代CAR的常规结构，并没有涉及到CAR-T的安全性控制。CN108251442A也公开了FLT3嵌合抗原受体及其应用，该专利中FLT3结合结构域为FLT3的配体，并不是FLT3的单链抗体。目前对于FLT3的单链抗体挖掘的较少，而对于人源性FLT3的单链抗体更少。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明提供一种抗FLT3嵌合抗原受体修饰的T细胞及其在制备治疗AML药物中的应用，实现以下发明目的：提高对肿瘤细胞的杀伤效果，设计的CAR-AntiFLT3 细胞活性受利妥昔单抗的控制，提高临床安全性。

为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：

一种抗FLT3嵌合抗原受体修饰的T细胞，将表达抗FLT3嵌合抗原受体的基因片段插入载体获得重组表达载体,采用慢病毒包装后感染活化的T细胞，得到抗FLT3嵌合抗原受体修饰的T细胞；所述嵌合抗原受体由以下模块依次串联得到：导引子Leader、单链抗体scFv-FLT3、CD8 Hinge区、CD8跨膜区、CD226-CD28共刺激区、CD3ζ胞内区、自剪切区T2A、自杀基因RQR8；