[发明专利]一种生产FecB基因g.A746G定点突变绵羊的试剂盒及其方法

说明书

本发明公开了一种生产FecB基因g.A746G定点突变绵羊的试剂盒及其方法。所述的试剂盒中含有FecB‑pegRNA的体外转录模板质粒、FecB‑sgRNA的体外转录模板质粒以及PE2mRNA的体外转录模板质粒，以FecB‑pegRNA的体外转录模板质粒、FecB‑sgRNA的体外转录模板质粒为模板经PCR扩增得到的FecB‑pegRNA体外转录模板序列如SEQ ID No.4所示，FecB‑sgRNA体外转录模板序列如SEQ ID No.5所示。将体外转录获得的pegRNA、sgRNA及PE2mRNA纯化后混合，注射入绵羊受精卵细胞质中，受精卵体外培养后移植入同种雌性绵羊输卵管中，生产的后代经检测后获得FecB基因g.A746G定点突变绵羊。本发明模拟自然界中存在的FecB基因g.A746G绵羊，同时与传统CRISPR/Cas技术相比极大地避免了随机突变、bystander突变、脱靶突变及基因组损伤，因此安全性更高。本发明为绵羊的精确基因编辑提供了重要技术支撑。

技术领域

本发明涉及一种生产FecB基因g.A746G定点突变绵羊的试剂盒及其方法，特别地，涉及一种利用新型基因编辑系统Prime Editing生产FecB基因g.A746G定点突变绵羊的试剂盒及其方法。属于动物基因工程和遗传修饰技术领域。

背景技术

CRISPR/Cas系统是在细菌和古细菌中发现的一种获得性免疫系统，能特异性地靶向并切割噬菌体DNA以抵御入侵。经人工改造后的CRISPR/Cas9技术借助sgRNA与基因组DNA序列的特异性识别与结合作用，能够实现对靶基因的定点切割，在生物学相关领域应用广泛，涉及到生物、医学和农业等。

单核苷酸多态性(SNP)是哺乳动物中最常见的遗传变异类型。据报道，大量单碱基突变与人类疾病及生产性状相关。单碱基编辑技术是目前常用的基因组定点突变方法，其能够实现A→G与C→T的点突变，但不能实现4种碱基的任意变换，同时在全基因组范围内存在着一定的脱靶效应。最近报道的一种新的基因编辑技术Prime Editing(PE)不仅保持了精准编辑，还大幅度减少了脱靶效应，同时能够实现4种碱基的任意变换。该技术是在dCas9蛋白上融合了一个反转录原件，同时在sgRNA的基础上又加入了两段新的序列——引物结合序列(Primer binding site，PBS)以及转录模板序列(RT template including edit，RT)。其基本工作原理如下：原有的sgRNA序列仍结合PAM序列后的约20个碱基，打开DNA双链，引导改造后的dCas9蛋白。PBS序列则在解螺旋的另一条单链上与设计位点结合，起到一个类似PCR过程中引物结合DNA单链后引导后续链合成的作用，引导后续的RT序列在反转录原件作用下的反转录过程，一般情况下，靶向编辑位点的编辑信息包含在RT序列中。

FecB基因是最早发现的控制绵羊高繁殖力的主效基因，对排卵数的影响呈加性效应，对产羔数的影响呈部分显性效应。一个FecB拷贝可增加1.3～1.6枚排卵数，0.9～1.2只产羔数，两个FecB拷贝可增加2.7～3.0枚排卵数，1.1～1.7只产羔数。研究表明，FecB基因的定点突变(g.A746G，p.Q249R)致使其高度保守区域中的谷氨酰胺突变为精氨酸，丧失部分生物学活性，降低其配体BMP4和GDF5对类固醇生成的抑制作用，加速颗粒细胞分化，促进卵泡发育及排卵，提高动物的繁殖性能。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种生产FecB基因g.A746G定点突变绵羊的试剂盒。

本发明的目的之二是提供一种利用所述的试剂盒生产FecB基因g.A746G定点突变绵羊的方法。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：