[发明专利]一种体外神经发育毒性替代模型

说明书

本发明公开了一种体外神经发育毒性替代模型包括体外神经细胞的选择、外源性物质的选择、试剂选择、体外神经细胞体外培养、受试物细胞毒性的检测、受试物抑制体外神经细胞分化为神经细胞能力检测、RT‑PCR法检测分化特异基因、受试物发育毒性的分析。建立体外神经发育毒性替代模型的细胞来源根据其复杂程度可用永生化细胞系，原代神经细胞及神经干细胞等。可观察的终点主要有细胞形态学、生物化学标记以及某些分子事件，如基因表达、细胞内信号转导等。随着生物技术的发展，有些终点可能成为高通量筛选的靶点。模型细胞大多来源于啮齿类动物，或来源于人胚胎干细胞以及脊髓源干细胞，这可以减少物种间实验结果外推所带来的不确定性。

技术领域

本发明涉及一种体外神经发育毒性替代模型，尤其涉及一种研究毒性物质对细胞诱导分化情况的体外神经发育毒性替代模型。

背景技术

神经发育毒性(developmental neurotoxicity，DNT)是指个体在发育过程中暴露于某些神经毒性物质后引起的神经系统结构和功能的异常改变，这种改变可以发生在生命周期的任何阶段。神经毒性物质通过对神经系统发育过程中的关键步骤，如神经细胞的增殖、迁移、分化、突触形成、髓鞘形成以及细胞凋亡等产生影响，进而引起个体的感觉、运动及各种认知功能改变，表现为个体发育产生某些缺陷，常见的有行为改变、智力低下、精神失常、孤僻症等。

目前，神经发育毒性评价的指导原则主要有美国环境保护署(US EPA)颁布的健康影响评价指南OPPTS以及欧洲经济共同体(OECD)颁布TG 426指导原则，其均是以体内动物试验为主，然而传统的体内方法费时、费力、浪费大量的实验动物；很难满足对大量化学物质进行神经发育毒性评价的需求。因此，寻找一种灵敏度高、经济、快速的体外神经发育毒性替代方法显得尤为重要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种体外神经发育毒性替代模型，具有研究毒性物质对细胞诱导分化情况的特点。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案为：一种体外神经发育毒性替代模型，其创新点在在于：所述体外神经发育毒性替代模型包括以下步骤：

(11)体外神经细胞的选择，体外神经细胞来源根据复杂程度为永生化细胞系、原代神经细胞和神经干细胞中的一种；

(12)外源性物质的选择，体外神经细胞暴露于不同浓度的外源性物质后，影响体外神经细胞的增殖、分化、迁移、突触；

(13)试剂选择，所述试剂包括DMEM高糖培养基、knock out-DMEM培养基、特级胎牛血清FBS、β-巯基乙醇β-ME、青霉酸钠P-S、谷氨酰胺L-Glu、羟乙基哌嗪乙磺酸HEPES、胰蛋白酶、非必需氨基酸NA、磷酸盐缓冲液PBS、丝裂霉素C、白血病抑制因子LIF；

(14)体外神经细胞体外培养，体外神经细胞的体外细胞复苏后，接种于备用的经丝裂霉素C处理完毕的体外神经细胞饲养层上，培养基维持培养；

(15)受试物细胞毒性的检测，基于培养基获得阴性对照组；

(16)受试物抑制体外神经细胞分化为神经细胞能力检测；

(17)RT-PCR法检测分化特异基因，以DL1500作为核酸分子量Marker，紫外灯下观察结果并照像；

(18)受试物发育毒性的分析，采用分析软件对上述分化获得的神经细胞内nestin基因扩增产物的凝胶电泳图像进行灰度分析，且以GAPDH为内对照基因，计算5-FU、DPH和青霉素G对体外神经细胞体外定向分化抑制率为50％时的作用浓度，即半数抑制ID₅₀，对体外神经细胞定向分化半数抑制浓度以ID₅₀D3nestin表示。