[发明专利]一种体外神经发育毒性替代模型

权利要求书

1.一种体外神经发育毒性替代模型，其特征在在于：所述体外神经发育毒性替代模型包括以下步骤：

(11)体外神经细胞的选择，体外神经细胞来源根据复杂程度为永生化细胞系、原代神经细胞和神经干细胞中的一种；

(12)外源性物质的选择，体外神经细胞暴露于不同浓度的外源性物质后，影响体外神经细胞的增殖、分化、迁移、突触；

(13)试剂选择，所述试剂包括DMEM高糖培养基、knock out-DMEM培养基、特级胎牛血清FBS、β-巯基乙醇β-ME、青霉酸钠P-S、谷氨酰胺L-Glu、羟乙基哌嗪乙磺酸HEPES、胰蛋白酶、非必需氨基酸NA、磷酸盐缓冲液PBS、丝裂霉素C、白血病抑制因子LIF；

(14)体外神经细胞体外培养，体外神经细胞的体外细胞复苏后，接种于备用的经丝裂霉素C处理完毕的体外神经细胞饲养层上，培养基维持培养；

(15)受试物细胞毒性的检测，基于培养基获得阴性对照组；

(16)受试物抑制体外神经细胞分化为神经细胞能力检测；

(17)RT-PCR法检测分化特异基因，以DL1500作为核酸分子量Marker，紫外灯下观察结果并照像；

(18)受试物发育毒性的分析，采用分析软件对上述分化获得的神经细胞内nestin基因扩增产物的凝胶电泳图像进行灰度分析，且以GAPDH为内对照基因，计算5-FU、DPH和青霉素G对体外神经细胞体外定向分化抑制率为50％时的作用浓度，即半数抑制ID₅₀，对体外神经细胞定向分化半数抑制浓度以ID₅₀D3nestin表示。

2.如权利要求1所述的一种体外神经发育毒性替代模型，其特征在在于：所述步骤(13)中的试剂选择配合试剂设备组合使用，所述试剂设备包括Olympus IX71倒置显微镜、TOMYLC-120低速离心机、Beckman低温高速离心机、Anke TGL-16B台式高速离心机、Biometra PCR仪、凝胶成像仪。

3.如权利要求1所述的一种体外神经发育毒性替代模型，其特征在在于：所述步骤(14)体外神经细胞体外培养中，取出-105～-190℃液氮冷冻条件下保存的体外神经细胞进行细胞复苏，接种于备用的经丝裂霉素C处理完毕的体外神经细胞成纤维细胞饲养层上，加入内含15％～30％FBS、0.1～0.3mmol/Lβ-ME、1％～5％HEPES液、1％～10％L-Glu、1％～3％NA及1×10⁹U/L LIF的knockout-DMEM培养基维持培养。

4.如权利要3所述的一种体外神经发育毒性替代模型，其特征在在于：所述体外神经细胞体外培养中，为保持其理想的未分化状态，当体外神经细胞团集落达到50％～80％融合时，即需传代。

5.如权利要求1所述的一种体外神经发育毒性替代模型，其特征在在于：所述步骤(15)受试物细胞毒性的检测中，分别将500个/200μlBALB/C(3T3)和体外神经细胞分别接种在96孔的培养板上，每孔中加入氟尿嘧啶、苯妥英钠和青霉素G至预设浓度，同时设立阴性对照组。

6.如权利要求1所述的一种体外神经发育毒性替代模型，其特征在在于：所述步骤(16)受试物抑制体外神经细胞分化为神经细胞能力检测中，悬滴、悬浮培养取体外培养生长旺盛的体外神经细胞，用0.75％胰蛋白酶消化成单细胞悬液，加入ES细胞培养基调整细胞密度至1×10⁸数量级后滴于10cm的细菌培养皿盖板上，每滴30μl，随即将培养皿盖倒扣于培养皿上，形成细胞悬滴。

7.如权利要求1所述的一种体外神经发育毒性替代模型，其特征在在于：所述步骤(17)RT-PCR法检测分化特异基因中，取不同浓度受试物作用下分化培养4天后的EBs，用0.75％胰蛋白酶消化成单细胞悬液，0.1mol/L PBS液清洗2遍后，采用Trizol试剂盒提取ES细胞总RNA，并用紫外分光光度计，选择A260/280检测以确定RNA浓度与质量；取1μ gRNA逆转录合成cDNA，基因PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，以DL1500作为核酸分子量Marker，紫外灯下观察结果并照像。