[发明专利]鸡传染性支气管炎标记疫苗毒株及其制备方法、疫苗

权利要求书

1.一种鸡传染性支气管炎标记疫苗毒株的构建方法，其特征在于，包括：

(1)构建A21963G沉默突变和G22170C沉默突变的IBV-Beaudette病毒全长cDNA重组质粒；

(2)转染细胞，拯救获得的病毒即为鸡传染性支气管炎标记疫苗毒株。

2.如权利要求1所述的鸡传染性支气管炎标记疫苗毒株的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，分别获取pIBVcDNA-1A质粒、pIBVcDNA-2B质粒、pIBVcDNA-3C质粒、pIBVcDNA-4D质粒和pIBVcDNA-5E质粒。

3.如权利要求2所述的鸡传染性支气管炎标记疫苗毒株的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，采用核苷酸序列如SEQ ID No.1～10所示的引物，分别构建pIBVcDNA-4X质粒、pIBVcDNA-5Y质粒和pIBVcDNA-6Z质粒，并连接形成A21963G沉默突变和G22170C沉默突变的IBV-Beaudette病毒全长cDNA重组质粒。

4.如权利要求3所述的鸡传染性支气管炎标记疫苗毒株的构建方法，其特征在于，步骤(2)包括：

(2.1)采用核苷酸序列如SEQ ID No.1～2所示的引物，以pIBCcDNA-4D质粒为模板扩增，然后与质粒载体连接，即得pIBVcDNA-4X质粒；

(2.2)采用核苷酸序列如SEQ ID No.3～8所示的引物，以pIBVcDNA-5E质粒为模板扩增，然后与质粒载体连接，即得pIBVcDNA-5Y质粒；

(2.3)采用核苷酸序列如SEQ ID No.9～10所示的引物，以pIBVcDNA-5E质粒为模板扩增，然后与质粒载体连接，即得pIBVcDNA-6Z质粒；

(2.4)将pIBVcDNA-1A质粒、pIBVcDNA-2B质粒、pIBVcDNA-3C质粒、pIBVcDNA-4X质粒，pIBVcDNA-5Y质粒和pIBVcDNA-6Z质粒连接，形成A21963G沉默突变和G22170C沉默突变的IBV-Beaudette病毒全长cDNA重组质粒。

5.如权利要求4所述的鸡传染性支气管炎标记疫苗毒株的构建方法，其特征在于，步骤(2.1)和步骤(2.3)中，所述质粒载体为pClone007 Blunt Vector；

步骤(2.2)中，所述质粒载体为T-Vector pMD19。

6.如权利要求4所述的鸡传染性支气管炎标记疫苗毒株的构建方法，其特征在于，步骤(2.4)中，将pIBVcDNA-1A质粒、pIBVcDNA-2B质粒、pIBVcDNA-3C质粒、pIBVcDNA-4X质粒，pIBVcDNA-5Y质粒和pIBVcDNA-6Z质粒分别采用BsmBI、BsaI、BsaI、BsaI、BsmBI和BsaI酶切，回收片段后连接，形成A21963G沉默突变和G22170C沉默突变的IBV-Beaudette病毒全长cDNA重组质粒。

7.如权利要求4所述的鸡传染性支气管炎标记疫苗毒株的构建方法，其特征在于，步骤(3)包括：

(3.1)将步骤(2.4)所得的连接产物转录；

(3.2)采用转录产物转染细胞，拯救获得的病毒即为鸡传染性支气管炎标记疫苗毒株。

8.一种鸡传染性支气管炎标记疫苗毒株，其特征在于，其由权利要求1～7任一项所述的构建方法构建所得。

9.一种鸡传染性支气管炎标记疫苗，其特征在于，其包括如权利要求8所述的鸡传染性支气管炎标记疫苗毒株。