[发明专利]三七细胞外囊泡的制备方法及其应用

说明书

本发明提供了一种三七细胞外囊泡的制备方法及其应用。本发明将植物中药三七主根碾磨过滤后采用差速离心的方法进行提取，通过精确的控制各步骤条件，制备得到的三七细胞外囊泡轮廓清晰，结构完整。进一步对提取得到的细胞外囊泡进行研究，发现其可以成功的转染至HSF细胞中，并对其凋亡和增殖产生影响。

技术领域

本发明涉及分子生物和医药领域，具体涉及一种三七细胞外囊泡的制备方法及其应用。

背景技术

人类皮肤衰老是一个不可避免的过程，主要表现为皮肤外观的变化，如皮肤松弛、失去弹性和皱纹的形成。人们普遍认为，皮肤衰老是由各种内因和外因共同驱动的。其中，真皮层纤维细胞是分泌细胞外基质的主要皮肤基质细胞。真皮层细胞可以合成或分泌胶原蛋白、弹性蛋白、透明质酸等细胞外基质成分。这些细胞外基质成分经加工组装成纤维，可以赋予皮肤弹性和韧性，帮助皮肤保持年轻。然而，在衰老过程中，细胞外基质逐渐降解并产生一些有害物质，极大的损害纤维细胞的功能。随着社会的进步和科技的发展，人们对衰老的认识不断深入的同时，对抗衰老的愿望也日益强烈，这就为抗衰老技术产品的开发提供了巨大的市场空间。

目前市面上已有各种方式来延缓皮肤衰老，比如各种美容产品、牛血清蛋白制剂等，但是这些产品大多数只起到物理性的作用。因此，开发更多安全有效，无毒无害的方法去调动皮肤的内在活力，从细胞水平上延缓衰老具有重要的研究意义。

目前已有用干细胞和尿液来源的细胞外囊泡来延缓皮肤层纤维细胞和真皮层纤维细胞的衰老的应用，但是不同的细胞外囊泡颗粒千差万别，生物学功能和运转特性也不尽相同。因此寻找一种能有效作用于人皮肤层纤维细胞的植物细胞外囊泡，通过提取并研究其是否可以有效作用于人真皮层纤维细胞，这对于推动中药细胞外囊泡的研究意义重大。

发明内容

针对现有技术所存在的技术问题，本发明提供了一种新鲜三七细胞外囊泡的制备方法和应用。通过该方法可以有效的对三七细胞中的外囊泡进行提取，提取得到的细胞外囊泡可以成功的转染至HSF细胞中，并对其凋亡和增殖产生影响。

本发明通过以下技术方案来实现上述技术目的：

本发明提供一种三七外囊泡的制备方法，包括以下步骤：

在温度≤37℃的条件下碾磨三七主根，将碾磨后的三七主根加入到缓冲溶液中，用脱脂纱布过滤掉残渣，收集液体；

将收集的液体在≤6℃，第一预设转速下离心并过滤，收集滤液并转移到超滤离心管中；

将超滤离心管中的滤液在≤6℃，第二预设转速下重复离心，弃去超滤管底部的水；

将超滤浓缩后的液体在第三预设转速下离心70～100min，收集沉淀；

用预冷的缓冲液重悬沉淀，并在第四预设转速下离心收集沉淀；

将收集的沉淀再次重悬即得；

其中第一预设转速为800～1500g，第二预设转速为1500～3000g，第三预设转速为8000～12000g。具体地，第一预设转速为1000g，第二预设转速为 2000g，第三预设转速为100000g。

本发明将新鲜植物中药三七碾磨过滤后离心，制备得到的三七细胞外囊泡轮廓清洗，结构完整。该方法中，三七主根碾磨时应保证机身温度不超过 37℃。

另外，本发明还采用差速离心的方法进行提取，在该方法中，需要严格控制离心次数、离心时间和转速，时间过短或者转速过小，无法充分提取外囊泡，次数过多或者转速过大，又会破坏外囊泡的结构，导致外囊泡的产率下降。

本发明中所用的缓冲液优选为PBS缓冲液，其制备方法如下：