[发明专利]脐带间充质干细胞再生修复机械灌注中肝脏损伤的方法

说明书

本发明涉及干细胞再生医学技术领域，具体地说，涉及脐带间充质干细胞再生修复机械灌注中肝脏损伤的方法。其包括以下步骤：脐带间充质干细胞的分离；细胞增殖能力的检测；体外诱导分化能力检测；细胞表面分子标志检测；菲力磁标记的的制备；普鲁士蓝染色鉴定菲力磁标记的脐带间充质干细胞；透射电镜鉴定菲力磁标记的脐带间充质干细胞；检测菲力磁标记对脐带间充质干细胞存活、增殖、分化的影响；菲力磁标记的脐带间充质干细胞灌装；移植肝脏机械灌注前经门静脉予以一次性无菌注射器注射。

技术领域

本发明涉及干细胞恢复技术领域，具体地说，涉及脐带间充质干细胞再生修复机械灌注中肝脏损伤的方法。

背景技术

器官移植是终末期器官衰竭患者现阶段最有效的治疗方法之一。近年来，随着供体保存、受者选择、外科技巧和术后管理等方面的改进及完善，患者的生存率和生活质量得到了明显提高和改善。慢性排斥反应是影响受者长期生存的最大障碍，且排斥反应会导致移植物功能不全，长期使用免疫抑制剂也会导致慢性感染和恶性肿瘤的高发。迄今为止，没有免疫抑制剂能够完全有效抑制器官移植后的排斥反应。移植免疫耐受的诱导是目前解决器官移植排斥反应较为理想的方法。干细胞疗法作为一种新兴的治疗免疫排斥及抗免疫炎症的生物治疗手段逐渐成为国内外研究的重点之一。间充质干细胞是一群来源于中胚层的多能干细胞，除了具有自我复制和多向分化潜能之外，它还具有低免疫原性和免疫调节作用的生物学特性，研究表明间充质干细胞能抑制异基因移植物抗宿主病发生、诱导免疫耐受并改善移植物功能及存活时间。间充质干细胞对T细胞、B细胞、树突状细胞、NK细胞和巨噬细胞等具有多种作用，通过发挥独特的免疫调节特性显著降低排斥反应的发生。因此间充质干细胞是一种理想的外源性修复种子细胞，不存在伦理、道德及应用安全性等方面的争议体外克隆技术也较成熟所以其在作为种子细胞修复肝脏损伤方面的研究具有广泛的发展潜力。

同时有研究表明通过机械灌注保存供肝能够减少供肝的缺血再灌注损伤。从而改善肝移植的效果。常温机械灌注 能够通过补充氧和营养物质，减少ATP丢失，促进保护性蛋白的产生，从而改善边缘供肝移植手术的疗效。然而，单纯常温机械灌注保存虽然能够提供能量但并不能修复肝窦内皮细胞等的损伤。

因此本发明拟用机械灌注前经门静脉注射脐带间充质干细胞来改善并修复常温机械灌注对移植肝脏的损伤。

发明内容

本发明的目的在于提供脐带间充质干细胞再生修复机械灌注中肝脏损伤的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供了脐带间充质干细胞再生修复机械灌注中肝脏损伤的方法，包括以下步骤：

S1、无菌操作，取脐带华通胶，剪碎成1-2mm²组织块，用无血清培养液混匀组织块，接种于75cm²培养瓶中，置于37℃、饱和湿度、5%二氧化碳培养箱中进行培养，细胞贴壁后，每隔3-4d换液，融合至80%-90%传代培养，加入胰酶消化，按比例传代至175cm²培养瓶中；

S2、取原代、2、4、6代细胞，加入无血清培养液制成细胞悬液，接种于6孔板内，第3天起，每间隔1天消化和统计细胞数量；

S3、细胞融合80%时收集细胞，接种于24孔板中，每孔加入无血清培养液0.8ml，3孔重复；细胞再次汇合至50%时分别加入干细胞成脂、成骨、成软骨诱导培养基，每3天更换一次培养液，第 14 天和第 21 天，分别用油红O染色，钙盐染色液染色和苏木素-伊红染色鉴定分化；

S4、将培养所得的3、4代细胞制成细胞悬液，加入各类抗人抗体试剂各5μl，鼠IgG1为阴性对照，4℃反应30min，流式细胞仪检测；

S5、取对数生长期的脐带间充质干细胞机械吹打成单细胞以5×10⁵的密度接种到含有菲力磁的培养基中孵育；

S6、普鲁士蓝染色鉴定菲力磁标记的脐带间充质干细胞；

S7、透射电镜鉴定菲力磁标记的脐带间充质干细胞；

S8、检测菲力磁标记对脐带间充质干细胞存活、增殖、分化的影响；