[发明专利]层析过程病毒灭活的方法及其应用

说明书

本发明涉及蛋白纯化技术领域，尤其是涉及一种层析过程病毒灭活的方法及其应用。层析过程病毒灭活的方法，包括如下步骤：调节细胞发酵液的pH至5.0～5.5后进行深层过滤处理，将滤出液进行阳离子层析上样，冲洗处理后，采用pH为3.4～3.8的缓冲液冲洗阳离子层析柱后，静置30min以上，洗脱。本发明在阳离子层析过程中进行低pH孵育病毒灭活，为后续纯化步骤节省pH调节、稀释等工艺环节，提高纯化过程整体效率；并且，省去的离线灭活步骤还能够省去大容量储存容器等，节约空间。

技术领域

本发明涉及蛋白纯化技术领域，尤其是涉及一种层析过程病毒灭活的方法及其应用。

背景技术

随着生物制药技术的进步，尤其是上游细胞发酵的技术发展，抗体表达量逐渐升高，由此给下游纯化带来很大的压力。目前制约下游纯化的最大障碍是捕获步骤的填料成本高以及生产效率较低。抗体的粗纯步骤目前主要是通过Protein A亲和层析来进行捕获，而广泛使用的Protein A填料普遍存在价格高昂，载量不高等问题。

生物制药界提出了很多种解决方案，如膜层析、新填料、连续流层析、阳离子层析捕获等等。其中阳离子层析捕获相较于亲和层析捕获，优势在于：1)载量高，配基稳定；2)流速高，生产效率高；3)价格低，成本低。用阳离子层析代替亲和层析进行捕获可以有效提高效率，并同时大大降低捕获的成本。

病毒灭活是血液制品、细胞表达制品病毒安全性评价中用于病毒去除的一个重要步骤。通常在Protein A亲和层析时，会用较低pH的流动相进行洗脱回收蛋白，从而十分便于后续进行低pH孵育病毒灭活的操作。然而，当用阳离子层析代替亲和层析后，通常是用含高电导率的、或者高pH的流动相进行捕获蛋白的回收。回收后的蛋白产品往往呈现高pH高电导率，十分不易于进行低pH病毒灭活处理。若强行进行低pH调节处理，需要先调低pH，再调高pH，再稀释，往往会出现稀释严重，电导率过高，样品浓度过低等一系列问题，不利于蛋白中间体的稳定性，以及会干扰后续纯化工艺的操作。另一种灭活方法是用表面活性剂和去污剂进行灭活(SD灭活)，而该方法会引入新的杂质，使得后续纯化步骤必须具备去除该杂质的能力，且对杂质的残留检测提出要求，即使在常规的纯化工艺中也不经常使用。捕获后灭活难以进行的问题，使得阳离子层析捕获在实际工艺开发和生产放大中的应用大大受限，无法充分发挥其提高效率，节约成本的优势。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供层析过程病毒灭活的方法，以解决现有技术中存在的采用阳离子层析取代亲和层析捕获后导致的病毒灭活困难等技术问题。

本发明的第二目的在于提供上述层析过程病毒灭活的方法在蛋白纯化中的应用。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

层析过程病毒灭活的方法，包括如下步骤：

调节细胞发酵液的pH至5.0～5.5后进行深层过滤处理，将滤出液进行阳离子层析上样，冲洗处理后，采用pH为3.4～3.8的缓冲液冲洗阳离子层析柱后，静置30min以上，洗脱。

本发明的方法采用在层析过程中进行病毒灭活的操作，先对发酵液进行预处理，在合适的条件下采用阳离子层析捕获预处理后的发酵液，用阳离子层析代替亲和层析进行捕获，可有效提高效率，同时降低捕获成本。在上样冲洗后，洗脱前，采用一定pH的缓冲液对捕获后的阳离子层析柱进行冲洗处理，且静置30min以上，使缓冲液与样品充分有效的接触，并且由于阳离子的结合特性，不会因为pH低而导致样品流失，能够实现层析在线灭活，节省步骤及设备空间，提高效率；并且采用一定pH的缓冲液能够兼顾保证产品纯度和灭活效果。

在本发明的具体实施方式中，所述pH为3.4～3.8的缓冲液包括醋酸钠-醋酸缓冲液、甘氨酸-盐酸缓冲液和柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中的任一种或多种。进一步的，所述缓冲液的浓度为20～100mM。