[发明专利]一种利用工程细胞进行基因编辑的系统及方法

说明书

一种利用工程细胞进行基因编辑的系统及方法，包括嵌入合成蛋白受体的工程细胞、靶细胞；所述工程细胞中含有CRISPR/CasRx系统及sgRNA基因序列；所述合成蛋白受体由胞外靶细胞识别结构域、天然Notch核心结构域、膜内水解多肽及效应因子组成；所述胞外靶细胞识别结构域能识别靶细胞表面的抗原分子；效应因子为CasRx酶及sgRNA的转录因子。本发明在工程细胞中对CasRx与gRNA进行表达，用于基因编辑以实现对靶细胞mRNA进行编辑，扩大工程细胞的适用范围，提高基因编辑的针对性、特异性，减少脱靶效应，减少集体非特异性反应，增加基因编辑的安全性，为基因编辑临床转化提供可行方案。

技术领域

本发明属于基因编辑领域，具体涉及一种利用工程细胞进行基因编辑的系统及方法。

背景技术

CRISPR/Cas系统是一种强大的生物技术工具，用于靶向基因组中的单个DNA和RNA序列。它可用于靶向基因序列的敲入、敲除和替换，以及通过结合特定序列在基因组和表观基因组水平上监测和调节基因表达。

CRISPR是一类广泛的短回文重复序列，广泛存在于许多原核生物中，包括大多数细菌和古细菌。在原核生物中，这些短重复序列与入侵细菌或古细菌的一些外来DNA序列(例如病毒DNA)互补。当病毒感染细菌时，细菌会产生这种DNA并与病毒DNA结合；通过与一种称为Cas的核酸酶一起工作，Cas酶会将入侵的DNA切割成碎片。因此，CRISPR/Cas是原核生物对抗病毒的一种获得性免疫防御机制，也是一种自然发生的基因组编辑工具。

由于缺乏基因组改变，CRISPR/Cas13被报道比现有的CRISPR/Cas系统更安全。在Cas13d家族中，CasRx也称为RfxCas13d，来自黄色瘤胃球菌，在人类细胞中具有最高的RNA切割活性和特异性。CasRx靶向RNA的效果也优于短发夹RNA(shRNA)干扰。重要的是，Cas13d核酸酶可以处理CRISPR阵列，实现多重靶向。CRISPR/CasRx的治疗潜力在使用AAV载体的新生血管性年龄相关性黄斑变性小鼠模型中得到了证明。这表明CRISPR/CasRx系统具有治疗潜力。

在合成生物学和细胞工程的新兴领域，一个基本目标是能够合理地改变细胞识别的细胞外信号，以及由此产生的细胞反应。定制的细胞传感/响应通路对于工程治疗细胞非常有用，使它们能够自主感知用户指定的疾病或损伤信号。Notch蛋白是空间结构上最直接的跨膜受体之一，其细胞内结构域包含一个转录调节因子，当同源细胞外配体结合后诱导膜内蛋白水解时，该调节因子从膜中释放出来。

合成Notch系统是一种嵌合型蛋白受体工具，通过对天然的Notch蛋白加以改造，可使其调控特定的细胞信号通路。其中，Notch的细胞内和细胞外结构域可以被替换，形成新的合成蛋白受体，从而实现细胞靶向调控和下游目的信号响应。合成Notch由细胞外抗原识别域(通常是单链可变片段，scFv)、Notch核心调控区和细胞内域(ICD)组成，Notch核心调控区包含负调节区NRR(negative regulatory region)和跨膜结构域TMD(transmembrane domain)两部分，其中NRR包含三个LNR结构(Lin12-Notch repeats,LNR-A,-B,and-C)和一个HD结构(heterodimerization domain；scFv识别出发送细胞上的抗原后，Notch核心调控区中的负调节区(NRR)的构象变化将信号传递到Notch核心调控区中的Notch跨膜结构，跨膜结构域的连续构象变化使切割位点暴露于金属蛋白酶和γ-分泌酶，蛋白水解裂解释放ICD，它通常是一种转录因子，允许触发下游信号传导。

神经胶质细胞是中枢神经系统的多功能、非神经元成分，具有多种表型，因其密切参与神经炎症和神经退行性疾病而备受关注。神经胶质表型的主要特征是它们对各种刺激的结构和功能变化，这些刺激可以是神经保护性的，也可以是神经毒性的。