[发明专利]一种诱导肿瘤细胞形成肿瘤干细胞的方法

说明书

本发明具体涉及一种诱导肿瘤细胞形成肿瘤干细胞的方法。其具体方法是将对数生长期的肿瘤细胞经同步化处理后以悬浮态接种于肿瘤干细胞诱导培养基中，间隔固定的时间周期性施以机械力悬浮，分散已贴壁的肿瘤细胞，继续培养即得。本发明通过同步化无血清处理、悬浮态接种、周期性悬浮分散的方法降低了细胞自身的粘附能力，使细胞直接进入悬浮态并完成干性肿瘤细胞的筛选过程，仅使用普通培养皿、移液枪、离心机等即可完成，在实现优质实验结果的同时打破了贵重耗材、高级设备、复杂技术限制，降低了实验成本、设备限制、技术门槛。

技术领域

本发明涉及肿瘤医学、细胞生物学技术领域，具体涉及一种诱导肿瘤细胞系形成肿瘤干细胞的方法。

背景技术

近年的研究证实，在肿瘤组织中存在着少数具有干细胞性质的细胞群体，这些细胞具有自我更新能力和多向分化潜能，被称为肿瘤干细胞；肿瘤干细胞可能是导致恶性肿瘤复发和转移的根本原因。绝大部分的实体肿瘤被认为起源于肿瘤干细胞，肿瘤干细胞可能是导致肿瘤临床治疗原发性和获得性耐药的重要原因之一，因此，近年来对于肿瘤干细胞的研究吸引了国内外肿瘤基础研究的广泛关注。但是，仍旧有很多的因素制约着肿瘤干细胞的研究，其中一个关键因素就是肿瘤干细胞的培养和筛选技术还不够成熟，无法大范围、大通量得对各种肿瘤细胞系进行广泛研究。

目前，常见的肿瘤干细胞的培养和筛选方法有以下几种：流式细胞仪分选法、无血清神经干细胞培养基成球培养法、免疫磁珠分离法等，其中成球培养法是最为常用的方法。成球培养法的原理是肿瘤干细胞被发现在无血清但富含一定细胞因子的培养条件下，可以成团生长繁殖，形成如葡萄串样的克隆肿瘤群，而普通肿瘤细胞却无法良好增殖，从而起到筛选和富集作用。

但是，现有的成球培养法的步骤一般是采用先贴壁再诱导的方法，诱导成功率低、实验周期极长、无法诱导粘附性强或高分化的细胞系，且需要采用定制的低粘附细胞培养板来降低肿瘤细胞的粘附作用进而降低细胞与培养板间的粘附力，实验成本较高。

发明内容

基于此，本发明提供了一种新的诱导肿瘤细胞形成肿瘤干细胞的方法，以解决背景技术中所提到的现有的成球培养存在的问题。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的：

本发明提供一种诱导肿瘤细胞形成肿瘤干细胞的方法，其不同之处在于，将对数生长期的肿瘤细胞经同步化处理后以悬浮态接种于肿瘤干细胞诱导培养基中，间隔固定的时间周期性施以机械力悬浮，分散已贴壁的肿瘤细胞，继续培养即得。

传统的成球培养法中一般是“静态等待”肿瘤细胞从贴壁细胞中“漂浮”出来，而在本发明的一种实施方式中，培养的过程中采用周期悬浮处理的步骤，使所有细胞全程处于“非贴壁无血清”的生存状态中，加速筛选过程，并且解决了贴壁性强、分化程度高的一类肿瘤细胞在初始贴壁期停滞、死亡导致容易失败的问题。

具体地，周期性悬浮的方法为每10～12h吹打贴壁细胞成单细胞悬液一次。

作为本发明的一种实施方式，同步化处理的步骤如下：在进入对数生长期的肿瘤细胞中加入无血清培养基培养，例如：可采用DMEM/F12培养基，但是对于某些原基础培养基非DM/F12的细胞系，亦可采用原基础培养基替换DM/F12，同步化处理的时间一般为10～12h。相较于传统诱导方法中接种细胞后再诱导的“先贴壁再诱导”方法，本方案通过直接将贴壁肿瘤细胞经同步化处理后收集并视作为悬浮细胞接种于肿瘤干细胞诱导培养基中进行“悬浮诱导”，干扰了接种后的非干性肿瘤细胞的贴壁生存，降低了非干性细胞裹挟干性肿瘤细胞贴壁存活而带来的诱导阻力，缩短了后续诱导实验周期。

作为本发明的一种实施方式，悬浮态接种的步骤如下：将同步化处理后的细胞消化收集，直接接种在肿瘤干细胞诱导培养基中即可。

其中，细胞的消化收集包括以下步骤：加入酶处理后离心收集，细胞消化收集步骤中所采用的消化液为常规的0.25％胰蛋白酶即可。