[发明专利]一种诱导肿瘤细胞形成肿瘤干细胞的方法

权利要求书

1.一种诱导肿瘤细胞形成肿瘤干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：将对数生长期的肿瘤细胞经同步化处理后以悬浮态接种于肿瘤干细胞诱导培养基中，间隔固定的时间周期性施以机械力悬浮，分散已贴壁的肿瘤细胞，继续培养即得。

2.根据权利要求1所述的诱导肿瘤细胞形成肿瘤干细胞的方法，其特征在于，周期性悬浮的方法为每10～12h吹打贴壁细胞成单细胞悬液一次。

3.根据权利要求1所述的诱导肿瘤细胞形成肿瘤干细胞的方法，其特征在于，所述同步化处理的步骤如下：在进入对数生长期的肿瘤细胞中加入无血清培养基培养。

4.根据权利要求3所述的诱导肿瘤细胞形成肿瘤干细胞的方法，其特征在于，同步化处理的时间为10～12h。

5.根据权利要求1所述的诱导肿瘤细胞形成肿瘤干细胞的方法，其特征在于，悬浮态接种的步骤如下：将同步化处理后的细胞消化收集，直接接种在肿瘤干细胞诱导培养基中即可。

6.根据权利要求5所述的诱导肿瘤细胞形成肿瘤干细胞的方法，其特征在于，细胞的消化收集包括以下步骤：酶处理后离心收集。

7.根据权利要求5或6所述的诱导肿瘤细胞形成肿瘤干细胞的方法，其特征在于，细胞消化收集步骤中所采用的消化液为0.25％胰蛋白酶。

8.根据权利要求1所述的诱导肿瘤细胞形成肿瘤干细胞的方法，其特征在于，培养过程中每隔20～24h更换肿瘤干细胞诱导培养基。

9.根据权利要求1所述的诱导肿瘤细胞形成肿瘤干细胞的方法，其特征在于，所述肿瘤干细胞诱导培养基为含有质量百分数为2％的B27细胞添加剂和1％的P/S、浓度为20ng/mL的人白血病抑制因子、20ng/mL的人碱性成纤维细胞生长因子和20ng/mL的人表皮生长因子的DMEM/F12培养基。

10.根据权利要求1所述的诱导肿瘤细胞形成肿瘤干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤:

(1)接种处于对数生长期且生长状态良好的肿瘤细胞于细胞培养皿中，培养基皿中的细胞培养液为：含有质量百分数为10％的胎牛血清、和1％的P/S的DMEM/F12培养基。

(2)无血清同步化处理：待细胞进入对数生长期后，更换无血清培养基持续10～12h；

(3)悬浮态接种：将同步化后的细胞消化收集，直接接种于肿瘤干细胞诱导培养基中，培养24h大部分细胞开始贴壁或呈蛙卵团块状漂浮；

(4)周期性悬浮：诱导开始后以12h为周期循环以下操作，使用移液器吹打底部贴壁细胞，借助水流产生的机械力将底部贴壁细胞吹起，并继续吹打成单细胞悬液，周期性循环重复此操作培养至细胞失去贴壁性、粘附性，而后逐渐长出肿瘤干细胞球；

(5)换液：定期更换新鲜的肿瘤干细胞诱导培养基，培养至肿瘤细胞小球逐步增殖为体积大、形状规则的肿瘤细胞球。