[发明专利]一种磁性纳米颗粒在细胞内形成蛋白冠成分的检测方法

说明书

一种磁性纳米颗粒在细胞内形成蛋白冠成分的检测方法，以人源性永生化细胞系和磁性纳米颗粒为材料，经共孵育，细胞裂解，磁性分离，热变性分离，蛋白质免疫印迹等步骤，检测磁性纳米颗粒在细胞内形成的蛋白冠中蛋白质成分。现有研究针对磁性纳米颗粒蛋白冠的形成仅限于磁性纳米颗粒与血浆，细胞培养基等细胞外蛋白质分子的蛋白冠形成，本发明填补了磁性纳米颗粒被摄取进入细胞后，与细胞内多种细胞器和蛋白质交互影响形成蛋白冠成分检测的实验方法空缺。可用于磁性纳米颗粒在经过人体循环到达靶器官细胞后，在细胞内与蛋白质分子结合形成蛋白冠的检测，并为进一步探究磁性纳米颗粒进入细胞后对细胞的功能和结构影响提供实验方法基础。

技术领域

本发明属于生物医药应用技术领域，涉及磁性纳米材料蛋白冠成分检测，特别涉及一种磁性纳米颗粒在细胞内形成蛋白冠成分的检测方法。

背景技术

磁性纳米颗粒在生物医学领域有广泛应用，一种主要应用方式是通过静脉输注方式进入体。磁性纳米颗粒接触拥有复杂蛋白质和细胞因子的生物流体，它们的表面将迅速吸附蛋白质，表面形成一种称为蛋白冠的结构。磁性纳米颗粒形成蛋白冠是一个复杂的过程，大量蛋白质通过各种非共价力(如静电、氢键和疏水相互作用)同时被吸附，而蛋白冠对磁性纳米颗粒的表征功能紧密相关。

磁性纳米颗粒在人体最终发挥相应功能，不仅需要经历血流等细胞外液环境，还需要经历细胞内更加复杂的蛋白质等生化分子环境。现研究认为磁性纳米颗粒经血流达到靶器官细胞，通常被细胞以内吞方式摄取，经过内体等囊泡运输，进入溶酶体处理后被释放或者滞留于溶酶体或者其他细胞器结构。由此可见，磁性纳米颗粒在细胞内代谢和功能发挥受限于细胞器或各类膜结构，形成蛋白冠的成分具有一定的特异性，研究对其在细胞内参与和调节细胞结构和功能具有的研究价值。

现阶段对于磁性纳米颗粒蛋白冠的研究局限于在人体或动物血流或者细胞培养基环境中蛋白冠形成领域，而磁性纳米颗粒进入靶器官细胞后需经历一系列复杂的细胞内细胞器和丰富的囊泡结构，以及与种类繁多的蛋白质和生化分子相互作用，最终发挥药物载体或成像等作用。因此，对磁性纳米颗粒蛋白冠的研究停留于细胞外液环境不能真实反映磁性纳米颗粒在体内的全部代谢活性过程。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种磁性纳米颗粒在细胞内形成蛋白冠成分的检测方法，针对磁性纳米颗粒进入细胞后与细胞器和蛋白质等相互作用的情况，以期真实反映磁性纳米颗粒在体内的全部代谢活性过程，为磁性纳米颗粒在亚细胞层面的研究提供基础。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种磁性纳米颗粒在细胞内形成蛋白冠成分的检测方法，包括以下步骤：

S1：磁性纳米颗粒的预处理：

将磁性纳米颗粒加入细胞培养基重悬，之后分离；

S2：共培养：

取人源性胰腺癌细胞系培养，弃去培养基后，加入不含动物血清及抗生素的新鲜细胞培养基，再加入S1预处理后的磁性纳米颗粒，轻柔混匀后，放回细胞培养箱内共孵育；

S3：细胞裂解：

共培养结束后，弃去培养基，加入细胞裂解缓冲液裂解，然后收集细胞裂解物至洁净的离心管内；

S4：磁性分离：

利用磁性将所述细胞裂解物中的磁性纳米颗粒及其蛋白冠与液体分离，液体作为阳性对照组；

S5：蛋白变性及洗脱：

将所述阳性对照组与SDS-PAGE蛋白上样缓冲液混合得到混合物A，将所述磁性纳米颗粒及其蛋白冠与SDS-PAGE蛋白上样缓冲液混合得到混合物B，将混合物A和B混合物分别加热，使混合物A和B蛋白质充分变性，并使混合物B磁性纳米颗粒与其蛋白冠洗脱分离；

S6：磁性分离：