[发明专利]一种磁性纳米颗粒在细胞内形成蛋白冠成分的检测方法

权利要求书

1.一种磁性纳米颗粒在细胞内形成蛋白冠成分的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：磁性纳米颗粒的预处理：

将磁性纳米颗粒加入细胞培养基重悬，之后分离；

S2：共培养：

取人源性胰腺癌细胞系培养，弃去培养基后，加入不含动物血清及抗生素的新鲜细胞培养基，再加入S1预处理后的磁性纳米颗粒，轻柔混匀后，放回细胞培养箱内共孵育；

S3：细胞裂解：

共培养结束后，弃去培养基，加入细胞裂解缓冲液裂解，然后收集细胞裂解物至洁净的离心管内；

S4：磁性分离：

利用磁性将所述细胞裂解物中的磁性纳米颗粒及其蛋白冠与液体分离，液体作为阳性对照组；

S5：蛋白变性及洗脱：

将所述阳性对照组与SDS-PAGE蛋白上样缓冲液混合得到混合物A，将所述磁性纳米颗粒及其蛋白冠与SDS-PAGE蛋白上样缓冲液混合得到混合物B，将混合物A和混合物B分别加热，使混合物A和B蛋白质充分变性，并使混合物B磁性纳米颗粒与其蛋白冠洗脱分离；

S6：磁性分离：

利用磁性分离出磁性纳米颗粒，所得剩余液体即为磁性纳米颗粒在细胞形成的蛋白冠成分，将其作为实验组；

S7：蛋白质成分鉴定：

将阳性对照组、阴性对照组与实验组蛋白样品使用蛋白质免疫印迹法(Western Blot)或质谱分析方法检测蛋白质成分，即可获得磁性纳米颗粒在细胞内形成蛋白冠的成分和分类信息，其中阴性对照组是细胞裂解缓冲液与SDS-PAGE蛋白上样缓冲液的混合物。

2.根据权利要求1所述磁性纳米颗粒在细胞内形成蛋白冠成分的检测方法，其特征在于，所述S1中，先取磁性纳米颗粒混悬液在涡旋振荡器振荡使其分散均匀，然后从中取磁性纳米颗粒加入另一个无菌离心管，并加入细胞培养基轻柔重悬，之后于磁性分离架静置，使磁性纳米颗粒集中吸附于离心管一侧管壁后，吸取并弃去离心管内液体，其中所述细胞培养基不含动物血清及抗生素成分。

3.根据权利要求1所述磁性纳米颗粒在细胞内形成蛋白冠成分的检测方法，其特征在于，所述S2，取人源性胰腺癌细胞系，当细胞铺满培养皿60-70％面积，吸出并弃去培养基，使用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，之后加入新鲜细胞培养基；所述S3，弃去培养基后使用磷酸盐缓冲液洗涤，之后再加入细胞裂解缓冲液。

4.根据权利要求1所述磁性纳米颗粒在细胞内形成蛋白冠成分的检测方法，其特征在于，所述S2，共孵育条件为静置培养8-24h，37℃，CO₂浓度设定为5％；所述S3细胞裂解全程在冰上进行，且所用试剂和器材均在4℃提前预冷处理。

5.根据权利要求1所述磁性纳米颗粒在细胞内形成蛋白冠成分的检测方法，其特征在于，所述S2，磁性纳米颗粒使用量与共培养细胞个数比例为25-50ug/10⁶个细胞；所述S4，将阳性对照组置于离心机以12000g离心15min后，吸取上清液转移至另一个洁净离心管中，4℃保存，用于后续实验；所述S5，加热条件为95℃，5-10min；所述SDS-PAGE蛋白上样缓冲液为5X浓度，其占最终混合物的体积为20％。

6.根据权利要求1所述磁性纳米颗粒在细胞内形成蛋白冠成分的检测方法，其特征在于，所述细胞裂解缓冲液的成分如下：

三(羟甲基)氨基甲烷(Tris Base)6.0-6.1g，氯化钠(NaCL)4.3-4.4g，吐温-20(Tween-20)1.0-1.5mL，曲拉通(Triton X-100)0.5-1.0mL，加双蒸水定容至500mL。

7.根据权利要求1或6所述磁性纳米颗粒在细胞内形成蛋白冠成分的检测方法，其特征在于，所述S3，细胞裂解缓冲液使用前加入磷酸酶抑制及蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF)，且细胞裂解缓冲液的体积与细胞数的比例为：150uL/10⁶个细胞。