[发明专利]一种甲状腺激素混合抗原的抗体筛选方法

权利要求书

1.一种甲状腺激素混合抗原的抗体筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：饲养及处理：饲养的小鼠观察无异样后，取小鼠阴性血清保存备用；

免疫前，将饲养的小鼠分成若干组并编号；第一组小鼠注射的免疫抗原为不同抗原的等量混合物；其余各组小鼠注射的为各不相同的单一免疫抗原，免疫剂量与第一组中对应的相同的免疫抗原相同；

S2：免疫：

对所述步骤S1中分组的小鼠，分别于第1d、14d、28d、42d各注射抗原一次；

S3：抗血清的分离与保存：

每次免疫抗原后的第7天，小鼠断尾采集血样，收集血清，备用；

S4：抗体筛选：

将所述步骤S3得到的血清按1:1000稀释，采用间接ELisa测定抗血清的吸光度值，以吸光度值为纵坐标，取样的天数为横坐标，得到抗体产生进程曲线。

2.根据权利要求1所述的混合抗原的抗体筛选方法，其特征在于，在所述步骤S3中，于每次免疫抗原7d后，即第7d、21d、35d、49d断尾采血，获取血清。

3.根据权利要求2所述的混合抗原的抗体筛选方法，其特征在于，在所述步骤S3中，采集到的血样在4℃放置2h，6000r/min离心10min，收集血清，并添加Proclin 300，分装，-20℃保存，备用。

4.根据权利要求1所述的混合抗原的抗体筛选方法，其特征在于，在所述步骤S1中，阴性血清于-20℃保存备用；

饲养的小鼠为6周龄左右雌性小鼠，饲养一周。

5.根据权利要求4所述的混合抗原的抗体筛选方法，其特征在于，在所述步骤S1中，免疫前，将饲养的9只小鼠分为3组，每组3只并编号，第一组1-3号，免疫抗原为T3和T4的等量混合物，免疫剂量为20μg/mL/只，T3和T4各10μg/mL/只；第二组4-6号，免疫抗原为T3，免疫剂量为10μg/mL/只；第三组7-9号，免疫抗原为T4，免疫剂量为10μg/mL/只。

6.根据权利要求1所述的混合抗原的抗体筛选方法，其特征在于，在所述步骤S2中，小鼠注射抗原前一周，在小鼠背部皮下注射1mg卡介苗；

首次免疫时，将抗原与等体积的完全弗氏佐剂乳化后，在小鼠颈背部皮下多点免疫，以后各次均与等体积不完全弗氏佐剂完全乳化后腹腔免疫。

7.根据权利要求5所述的混合抗原的抗体筛选方法，其特征在于，在所述步骤S4中，间接ELisa测定方法如下：

S4-1包被：T3抗原、T4抗原分别用包被液溶解稀释包被酶标板，包被浓度为1μg/mL，每孔加100μL，放于37℃恒温2小时或4℃过夜；

S4-2封闭：弃去包被液，用PBST洗涤，洗板3次，每孔加入200μL的封闭液，放于37℃恒温箱温育1h或4℃过夜；

S4-3加一抗：弃去封闭液，拍干，加入对应的稀释好的抗血清，每孔加100μL，同时作空白，阴性，阳性对照孔，放于37℃恒温箱温育1h；

S4-4加酶标二抗：弃去一抗，用PBST洗涤，洗板3次，拍干；加入羊抗鼠酶标二抗，每孔加100μL，放于37℃恒温箱温育30min；

S4-5显色：弃去二抗，用PBST洗涤，洗板4次，拍干后，加入配好的显色液，A液：B液体积比为1：1，每孔加100μL；显色3-10min；

S4-6终止：每孔加入100μL终止液；

S4-7读数：置于酶标仪上用450nm波长读数，保存并打印数据。

8.根据权利要求1-7任一项所述的混合抗原的抗体筛选方法，其特征在于，所述步骤S1中，第一组小鼠注射的免疫抗原为结构相似的不同抗原的等量混合物。

9.根据权利要求8所述的混合抗原的抗体筛选方法，其特征在于，所述步骤S1中，每只每次免疫剂量200-400μL。