[发明专利]一种稳定表达CD163蛋白的猪肾细胞系及其构建方法和应用

说明书

本发明属于细胞重组与蛋白表达技术领域，具体涉及一种稳定表达CD163蛋白的猪肾细胞系及其构建方法和应用，本发明的猪肾细胞系PK15‑CD163于2021年11月11日送往广东省微生物菌种保藏中心保藏，保藏编号为GDMCC No:62053。本发明是通过将目的基因CD163导入到猪基因组的ROSA26安全位点，从而构建得到的，所得细胞系可以将外源基因整合入基因组内已知的安全位点，实现转入基因的正常表达而又不影响细胞的正常生理功能。其构建过程简单，可重复性好，效率高，克隆准确度高，能高效确保正确克隆的获取，可以为蓝耳病毒的分离及病毒与宿主的致病机制研究等提供参考。

技术领域

本发明属于细胞重组与蛋白表达技术领域，具体涉及一种稳定表达CD163蛋白的猪肾细胞系及其构建方法和应用。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)，又称猪蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染引起的一种危害大、控制难的传染性免疫抑制性疾病，以妊娠母猪的繁殖障碍(流产、死胎、木乃伊胎)及各种年龄猪特别是仔猪的呼吸道疾病为特征。该病是目前主要引起猪繁殖障碍和呼吸系统疾病的主要疫病之一。 PRRS现已遍布于全世界主要养猪国家和地区，其中高致病性蓝耳病属于农业部规定的“一类动物疫病”，已经严重威胁养猪业健康发展。

清道夫蛋白(CD163)是猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染易感细胞受体。有研究表明，CD163在确定PRRSV感染中具有关键性的作用，PRRSV必须通过特异性受体诱导才能入侵宿主细胞，而CD163就是其中一个关键受体，CD163的转基因表达导致多种细胞变得易感PRRSV。因此，构建稳定表达CD163的细胞系，有利于病毒增殖和疫苗生产以及探讨CD163在病毒感染中的作用机制。

将外源基因引入细胞或者动物中对于生物学及药学研究具有重要的意义，而这些都取决于转入基因功能的可靠性和可预测性，这需要在转入基因的同时不扰乱内源基因和/或其他调控因子的功能，而且还要求将基因整合到宿主基因组后，宿主可以稳定表达和传代，且无副作用。

因此，为了克服上述问题，亟需一种稳定表达CD163蛋白的细胞株，以实现CD163的稳定高效表达，为病毒增殖、疫苗生产和致病机理研究提供平台。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明的首要目的是提供一种稳定表达CD163蛋白的猪肾细胞系。

本发明的第二个目的是提供上述稳定表达CD163蛋白的猪肾细胞系的构建方法。

本发明的第三个目的是提供上述稳定表达CD163蛋白的猪肾细胞系的应用。

本发明的上述第一个目的是通过以下技术方案来实现的：

一种稳定表达CD163蛋白的猪肾细胞系PK15-CD163，所述PK15-CD163细胞于于2021 年11月11日送往广东省微生物菌种保藏中心保藏，保藏编号为GDMCC No:62053。

CD163作为富半胱氨酸清道夫受体(scavebger receptor cysterine-richdomain，SRCR)超家族的主要成员之一，在单核细胞/巨噬细胞表面特异性表达，其I型跨膜蛋白结构是PRRSV 感染细胞必需的结构，其生物学功能与受体分子与细胞膜的锚定过程密切相关。因此，构建稳定表达CD163的细胞系，对猪蓝耳病的防治具有重要的意义。

本发明的上述第二个目的是通过以下技术方案来实现的：

上述稳定表达CD163蛋白的猪肾细胞系PK15-CD163的制备方法，包括以下步骤：

S1、将目的基因CD163连接至猪ROSA26-Donor载体上，构建得到猪 ROSA26-Donor-CD163重组质粒；