[发明专利]一种宏基因组血液样本绝对定量的产品、方法及其应用

说明书

本发明涉及宏基因组测序技术领域，具体公开一种宏基因组血液样本绝对定量的产品、方法及其应用，本发明方法通过选择自研标签序列，通过拟合曲线实现血液样本中病原菌的拷贝数定量。

技术领域

本发明涉及基因测序技术领域，具体涉及一种宏基因组血液样本绝对定量的产品、方法及其应用。

技术背景

中华医院感染学杂志中一项回顾性研究显示血液科2012年1月-2013年6月538例血液病患者，发生感染的有76例，感染率为14.13％。由于炎性反应轻使炎症不易局限，局部感染常扩散为全身感染，导致败血症或感染中毒性休克等严重感染形式，病死率高，治疗的难度大，因此宏基因组检测技术(mNGS)应运而生。为了更早期快速的为患者提供合理的用药指导，mNGS检测技术的准确性显得尤为重要。

目前市面上大多数mNGS检测报告中只呈现血液样本中检出的病原菌数目和相对丰度(以属为总体)，实际病原菌的细胞数是未知的，这使得临床医生对结果的判读和分析存在一定局限。为了更好实现宏基因组在不同患者血流感染程度的诊断和同一患者治疗过程的动态监测的作用，鉴于此，提出本发明。

发明内容

本发明要解决的核心技术问题是寻求一种能够绝对定量宏基因组样本(尤其血液样本) 中微生物感染的方法。

为解决上述技术问题，本发明提出如下技术方案：

本发明首先提供一种宏基因样本绝对定量的方法，所述方法包括如下步骤：

1)取宏基因组待检样本，加标签序列混合物后混匀，得混合样本；

2)混合样本DNA提取、建库和测序，获得下机数据；

3)分析下机数据中病原菌及标签序列的各自检出比例，所述检出比例为病原菌或标签检出序列数占总序列数的比例；

4)确立样本拟合线性关系，以每种标签序列检出比例为横坐标，对应标签的已知质量为纵坐标，拟合出样本线性关系公式：y＝kx；

5)病原菌定量：根据样本拟合线性关系y＝kx和病原菌检出比例x，计算对应病原菌的质量；定义质量和拷贝数换算公式，计算病原菌拷贝数；

进一步的，所述拷贝数＝6.02*10^23*10^(-9)*质量(ng)/(基因组长度bp*660g/mol)。

进一步的，所述标签序列混合物中包括选自SEQ ID NO.1-10中任一或多个标签；

优选的，所述标签序列个数为3个；

更优选的，所述标签序列如SEQ ID NO.1-3所示。

进一步的，所述标签序列混合物中SEQ ID NO.1:2:3标签浓度比为50-100:5-10:0.5-1；

优选的，所述SEQ ID NO.1:2:3标签浓度比为100:10:1。

进一步的，所述标签序列混合物的制备方法为将SEQ ID NO.1、2、3所示标签分别按照浓度比＝100:10:1配制混合物，分装30ul体系待用。

进一步的，所述样本为血液样本。

本发明还提供一种用于宏基因组血液样本绝对定量的标签序列，所述标签序列包括选自 SEQ ID NO.1-10中任一或多个；

优选的，所述标签为三个；

更优选的，所述标签为SEQ ID NO.1-3。

进一步的，所述SEQ ID NO.1:2:3浓度比为50-100:5-10:0.5-1；

优选的，浓度比为100:10:1。