[发明专利]一种环状RNA的高效表达方法及表达载体

权利要求书

1.一种环状RNA的高效表达方法，其特征在于，所述环状RNA的高效表达方法包括以下步骤：

步骤一，克隆环状RNA全长序列至pCRE5载体,命名为pCRE5-circRNA；

步骤二，将pCRE5-circRNA质粒瞬时转染至目标细胞或包装成慢病毒感染目标细胞，并分别对目标细胞进行RNA抽提和逆转录；

步骤三，环化引物设计及检测PCR体系构建。

2.如权利要求1所述环状RNA的高效表达方法，其特征在于，步骤一中，所述克隆环状RNA全长序列至pCRE5载体，包括：

(1)PCR扩增F-circSR1全长；

(2)使用Vazyme ClonExpressTM II One Step Cloning Kit将获取的片段与PCRE5载体进行重组连接，将F-circSR1克隆至环状RNA过表达区之间，命名为pCRE5-F-circSR1。

3.如权利要求2所述环状RNA的高效表达方法，其特征在于，步骤(1)中，所述PCR引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：1；

步骤(2)中，使用Phana酶为Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase，50μL反应体系，PCR反应条件为：

PCR反应条件

4.如权利要求1所述环状RNA的高效表达方法，其特征在于，步骤一中，所述PCR产物回收扩增片段，全长1907bp。

5.如权利要求1所述环状RNA的高效表达方法，其特征在于，步骤二中，所述RNA抽提，包括：

(1)使用Lipo2000将pCRE5-F-circSR1质粒瞬时转染至H1299或A549或其他细胞，24h后收获RNA；

(2)提取F-circSR1过表达细胞RNA：在6孔板细胞中加入Trizol 1mL裂解细胞，充分混匀，室温静置5min；

(3)加200μL氯仿，充分混匀，室温静置3min，1200g 15min 4℃；

(4)取上清约500μL，加入500μL异丙醇，充分混匀，室温静置10min，12000g 10min 4℃；

(5)弃上清，留沉淀，加入1mL 75％的乙醇，混匀，7500g 5min 4℃；

(6)弃乙醇，晾干沉淀，加入DEPC水混匀，立即放冰上；

(7)用1μL RNA测浓度。

6.如权利要求1所述环状RNA的高效表达方法，其特征在于，步骤二中，所述逆转录，包括：

(1)10μL RNA，2μL Random Primer，85℃，3min；

(2)10*RT buffer 2μL，M-Mlv 1μL，inhibitor 1μL，RNase free water 4μL；

(3)65℃1.3h，80℃10min，store at-20℃。

7.如权利要求1所述环状RNA的高效表达方法，其特征在于，步骤三中，所述PCR引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：2。

8.如权利要求1所述环状RNA的高效表达方法，其特征在于，步骤三中，使用Phana酶为Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase，50μL反应体系，

PCR反应条件为：

PCR反应条件

9.如权利要求1所述环状RNA的高效表达方法，其特征在于，步骤三中，1.5％琼脂糖胶电泳PCR片段长度675bp。

10.一种应用如权利要求1～9任意一项所述环状RNA的高效表达方法构建得到的环状RNA的高效表达载体，其特征在于，所述新型环状RNA表达载体中环状RNA的上游侧翼序列为SEQ ID NO：3，所述新型环状RNA表达载体环状RNA的下游侧翼序列为SEQ ID NO：4，所述新型环状RNA表达载体核心序列为SEQ ID NO：5。