[发明专利]可示踪脐带间充质干细胞及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种可示踪脐带间充质干细胞，其特征在于，所述可示踪脐带间充质干细胞过表达LMP-1蛋白。

2.一种如权利要求1所述的可示踪脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提供脐带间充质干细胞；

2)将目的基因LMP-1连接到慢病毒载体pLVX上，构建得到慢病毒表达载体pLVX-LMP-1-T2A；

3)慢病毒包装，获得含有LMP-1基因的重组慢病毒；

4)用重组慢病毒感染脐带间充质干细胞，得到修饰有LMP-1基因的脐带间充质干细胞，即为过表达LMP-1蛋白的所述可示踪脐带间充质干细胞。

3.根据权利要求2所述的可示踪脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中，所述慢病毒载体pLVX上还连接有EGFP报告基因，从而构建得到慢病毒表达载体pLVX-LMP-1-T2A-EGFP，最终得到的可示踪脐带间充质干细胞中还修饰有EGFP报告基因。

4.根据权利要求3所述的可示踪脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤1)具体包括：

1-1)洗净脐带，在PBS溶液中分离去除脐动脉、脐静脉以及脐带表面的外膜，再切割成组织块，然后将组织块平铺在培养皿中，加入培养基；以上操作于冰台上进行；

1-2)将培养基置于37℃下培养；

1-3)细胞培养至80％-90％融合率时，消化传代；

1-4)向含有组织块的培养皿中加入PBS缓冲液使多数组织块自然飘起，吸除旧的培养基及漂浮的组织块，并用PBS溶液清洗；

1-5)加入0.25％的Trypsin，37℃恒温箱消化1-2min；

1-6)吸去Trypsin，加培养基终止消化并将细胞吹打均匀；

1-7)将细胞悬液转移到离心管中，离心，吸去上清，留沉淀；

1-8)向沉淀中加入培养基使沉淀重悬，在新的培养皿中加入新鲜培养基，并将细胞悬液均匀滴入，晃匀，37℃培养箱中培养，获得用于感染的脐带间充质干细胞。

5.根据权利要求4所述的可示踪脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤1)具体包括：

1-1)洗净脐带，在PBS溶液中分离去除脐动脉、脐静脉以及脐带表面的外膜，再切割成组织块，然后将组织块平铺在10cm的培养皿中，加入培养基；以上操作于冰台上进行；

1-2)将培养基置于37℃下培养；

1-3)细胞长至80％-90％融合率时，消化传代；

1-4)向含有组织块的培养皿中加入PBS缓冲液使多数组织块自然的飘起，吸除旧的培养基及漂浮的组织块，并用PBS溶液清洗两次；

1-5)加入2ml 0.25％的Trypsin,37℃恒温箱消化1-2min；

1-6)吸去Trypsin，加2ml培养基终止消化并将细胞吹打均匀；

1-7)将细胞悬液转移到10ml的离心管中，1000r/min下离心5min，吸去上清，留沉淀；

1-8)向沉淀中加入1ml培养基使沉淀重悬，在新的培养皿中加入8-10ml新鲜培养基，并将细胞悬液均匀滴入，晃匀，37℃培养箱中培养，获得用于感染的脐带间充质干细胞。

6.根据权利要求4或5所述的可示踪脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中，得到慢病毒表达载体pLVX-LMP-1-T2A-EGFP后，通过EcoRI和BamHI对pLVX-LMP-1-T2A-EGFP进行双酶切验证，酶切结果正确后再进行后续处理。