[发明专利]一种肿瘤pH响应电荷反转负载miRNA纳米复合物的制备方法

说明书

本发明提供了一种肿瘤pH响应电荷反转负载miRNA纳米复合物的制备方法。其制备为：1)聚乙烯亚胺侧基接枝对甲苯磺酰精氨酸得PER；2)二甲基马来酸酐改性聚乙烯亚胺得PEI‑DMA；3)将PER与miRNA自组装得PER/miRNA二元复合物；4)将PEI‑DMA与PER/miRNA二元复合物自组装制备纳米复合物。本发明制备过程简单，制备所得的电荷反转纳米复合物具有pH响应电荷反转的特性，在肿瘤部位pH的环境下发生特异性的电荷反转，增强靶向性和细胞摄取，有效控制释放miRNA到目的部位实现基因治疗，降低对其他部位的副作用，达到miRNA有效传递和高转染效果，在基因治疗方面有广泛应用前景。

技术领域

本发明属于聚阳离子基因载体材料领域，具体涉及一种肿瘤pH响应电荷反转负载miRNA纳米复合物的制备方法。

背景技术

MicroRNAs(miRNAs)是一类高度保守的小非编码RNA分子，可以调控大多数人体基因的表达，对细胞的分化、增殖、凋亡进行多种机制的调控。所以现在不少miRNA都确认为是治疗癌症有效特异性基因药物。但单独的miRNA治疗会存在半衰期相对较短，细胞摄取较差，核酸酶快速降解，血液稳定性差的局限。阳离子聚合物聚乙烯亚胺(PEI)在生理条件下可以与带负电荷的RNA通过静电作用自组装为纳米尺寸带正电荷纳米复合物(polyplex)，有效包覆核酸避免过早降解，是包覆核酸的纳米颗粒金标准，但是高的正电荷会被血清中的蛋白吸附造成血液循环时间减少同时带来严重的细胞毒性。提高转染性能和降低细胞毒性是阳离子聚合物载体研究的重点。响应性聚合物材料随环境的变化如p H、温度、氧化还原等发生相应的物理化学性质变化，在特定部位有效控制释放药物。利用正常组织和肿瘤组织之间的pH差异设计的pH响应载体可以靶向肿瘤部位释放负载基因，对于提高药物或基因的使用效果非常有帮助。近年来，pH响应电荷反转型载体受到越来越多的关注，如何在miRNA中实现pH响应电荷反转对于增加基因治疗中的靶向性、提高稳定性至关重要。

发明内容

本发明的目的在于针对现有的技术中，基因治疗中核酸易降解、无靶向性的缺点，提供了一种肿瘤pH响应电荷反转负载miRNA纳米复合物的制备方法。制备所得的电荷反转纳米复合物具有pH响应电荷反转的特性，在肿瘤部位pH的环境下发生特异性的电荷反转，增强靶向性和细胞摄取，有效控制释放miRNA到目的部位实现基因治疗，降低对其他部位的副作用，达到miRNA有效传递和高转染效果。

为了解决上述技术问题，本发明提供以下技术方案：

提供一种肿瘤pH响应电荷反转负载miRNA纳米复合物的制备方法，包括以下步骤：

1)聚乙烯亚胺(PEI)侧基接枝对甲苯磺酰精氨酸得PER；

2)二甲基马来酸酐(DMA)改性聚乙烯亚胺得PEI-DMA；

3)将步骤1)所得PER与miRNA自组装得PER/miRNA二元复合物；

4)将步骤2)所得PEI-DMA与步骤3)所得PER/miRNA二元复合物自组装制备得到肿瘤pH响应电荷反转负载miRNA纳米复合物(PEI-DMA/PER/miRNA)。

按上述方案，所述步骤1)中，聚乙烯亚胺与对甲苯磺酰精氨酸的摩尔比为1:60～1:240。

按上述方案，聚乙烯亚胺分子量为10K～25K。

按上述方案，所述步骤1)中，聚乙烯亚胺侧基接枝对甲苯磺酰精氨酸具体步骤为：对甲苯磺酰基精氨酸、1-羟基苯并三唑和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺溶于二甲基甲酰胺中，混合均匀后，再加入聚乙烯亚胺的二甲基甲酰胺溶液和二异丙基乙胺进行酰胺反应，在去离子水透析后冷冻干燥得到黄色固体。最后在三氟乙酸中加入得到的固体进行侧基脱保护还原，反应完成后用无水乙醚滴加析出沉淀，冷冻干燥得到PER。