[发明专利]一种适用于酶解小鼠脑组织的酶解液、细胞分离的方法及其应用

说明书

本发明公开了一种适用于任一时期小鼠脑组织细胞分离的酶解液，以及使单细胞悬液低损失的优化方法，本发明所述的方法得到单细胞悬液中活细胞占比优于现有技术方法。这些优点可以让本领域技术人员完成小鼠各个时期脑组织细胞的分离且取得高活率、高得率、低杂质占比的细胞悬液，或使分离得到的细胞能继续应用于后续单细胞测序实验中，拿到更加真实且有意义的结果，为进一步明晰疾病机理和疾病的治疗提供了更完备的保障。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种适用于酶解小鼠脑组织的酶解液、细胞单细胞悬液的制备方法及其应用。

背景技术

单细胞测序技术自问世以来，对生命科学研究产生了颠覆式的影响，革新了众多领域的研究范式与基本方法，如免疫生物学、肿瘤生物学、发育生物学等。在脑科学研究中，单细胞测序对解析神经元在特定生理、病理状态下的功能，鉴别不同细胞在发育或疾病进展中的作用带来了详尽的数据，揭示了深刻的分子机理机制，也已成为脑科学研究中最强有力的技术手段。其流程包括四个操作步骤：样本制备、单细胞分离、测序、数据分析。其中样本制备是最为关键的第一步，其质量决定了后续操作的成败。

目前，脑科学研究中小鼠是最为常用的模式动物，但不同时期的小鼠脑组织结构复杂，脑组织在样本制备过程中存在诸多问题，如细胞活率低、纯度低、部分细胞无法获得等，极大的限制了单细胞测序技术的应用，对结果的可靠性产生了很大影响，如《Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/NeuronMyelinating Co-Cultures from Post-Natal Murine Tissues》一文中对小鼠脑组织的解离方法。仅适用于新生鼠1-7天的脑组织细胞分离，对中年、老年鼠脑组织细胞分离则会出现细胞数量极少、结团率高等问题，无法应用于中年、老年鼠脑组织。而《PharmacologicalInhibition ofMitochondrial Carbonic Anhydrases Protects Mouse CerebralPericytes from High Glucose-Induced Oxidative Stress andApoptosis》文献报道的制备单细胞悬液的方法适用于12周小鼠脑组织的分离，对新生鼠单细胞分离效果不理想，呈现细胞数量及类型均偏少的现象。因此，现有技术中单一的酶解配方，无法适用于任一时期的鼠脑组织单细胞分离。

综上，现有技术对不同时期小鼠的解离结果差异较大。其关键点在于酶解液配方，酶解液配方的变化会改变组织解离的偏好性，而对于单细胞测序来说，解离的偏好性会导致本领域技术人员无法全面的更深层次挖掘数据，无法全面了解脑组织的内在机理。因此，急需一种同时适用于各个发育时期小鼠脑组织的细胞分离方法来解决这一问题，推进脑科学基础科研进程。

发明内容

为克服现有技术存在的缺陷，本发明提出了一种适用于任一时期小鼠脑组织细胞分离的酶解液，以及使单细胞悬液低损失的优化方法，本发明所述的方法得到单细胞悬液中活细胞占比优于目前现有技术方法(本发明制备的单细胞悬液中活细胞占比为90％-95％、碎片杂质占比为1％～10％、细胞结团占比为1％～5％，现有技术分别对应为80％-90％、10％-20％、1％-10％)。本发明可以使组织分离得到的单细胞数量更多酶解后得率为5×10⁶-7×10⁶，经过优化后的悬液质量更为优质，纯度更高，碎片占比为1％-10％，结团占比为1％-5％，损失更低，优化后细胞数量为3×10⁶～6×10⁶个。对于进行后续单细胞测序研究有着更高的价值，这些优点可以让本领域技术人员完成小鼠各个时期脑组织细胞的分离且取得高活率、高得率、低杂质占比的细胞悬液，或使分离得到的细胞能继续应用于后续单细胞测序实验中，得到更加真实且有意义的结果，为进一步明晰疾病机理和疾病的治疗提供了更完备的保障。

本发明提出了一种适用于小鼠脑组织细胞分离的酶解液，包括木瓜蛋白酶，胶原酶I，DNase I。