[发明专利]一种尿液中外泌体的富集方法

说明书

本发明公开了一种尿液中外泌体的富集方法，包括向待测尿液样本中加入结合缓冲液及硅铝酸盐材料，得到混悬液；将所述混悬液孵育后，进行高速离心，去除上清液，保留沉淀Ⅰ；采用清洗缓冲液重悬所述沉淀Ⅰ重悬得到重悬液，将所述重悬液高速离心后去除上清，保留沉淀Ⅱ，重复该步骤数次，最后得到包含外泌体的沉淀。本发明采用硅铝酸盐材料及相应结合缓冲液，可有效富集尿液中外泌体；并且采用在线酶解的方式，可直接对所富集的外泌体蛋白质组进行后续的检测分析。本发明方法操作简单，富集速度快，只需要通过孵育‑离心‑洗涤‑离心4个步骤就可完成尿液中外泌体的富集，提高检测灵敏度的同时减少人为操作误差。

技术领域

本发明属于蛋白质组学技术领域，具体地，涉及一种尿液中外泌体的富集方法。

背景技术

外泌体是由多种细胞包括肿瘤细胞分泌的、直径为30～150nm、具有脂质双层膜结构的细胞外囊泡。因其特殊的分泌方式，外泌体携带了其来源细胞的生物信息，包括蛋白质、核酸、脂质等，在肿瘤微环境的形成、血管生成、炎症反应、调节免疫、微转移等过程中起着至关重要的作用。外泌体结构稳定，可自由通过各种生理屏障，并广泛分布于血液、尿液等体液中。尿液相对其他体液具有取样简单、保存方便、侵入性更低等特点，同时含有大量外泌体等细胞外囊泡(EVs)，在疾病诊疗等临床领域意义重大，特别是对于患有肾脏疾病的患者，尿液外泌体提供的信息可直接反应肾脏的生理状态，既可能作为肾脏疾病的新型分子标志物，也可能为肾脏疾病的治疗提供治疗靶标或发挥潜在治疗作用。

目前外泌体的分离常采用超速离心法、密度梯度离心法、体积排除色谱法、聚合物沉淀法和免疫亲和法等，这些方法存在分离时间长、操作繁琐、成本高、分离效率低下等问题，开发快速、高效的外泌体富集方法是实现尿液中外泌体蛋白质研究的首要任务。铝硅酸盐材料如云母、高岭土、沸石等，其具有天然的孔道结构和优异的选择性，特别是多孔性沸石材料，由硅氧四面体或铝氧四面体通过氧桥键相连而形成，具有分子尺寸大小(通常为0.3～2.0nm)的孔道和空腔体系、稳定的骨架结构、以及高的比表面积等，在气体的吸附分离、离子交换以及石油催化裂化等领域有着广泛的应用。但是目前没有利用该类材料富集尿液中外泌体方面的探索研究。

发明内容

发明目的：针对目前尿液中外泌体富集方法的局限性，本发明提供了一种尿液中外泌体的富集方法，其中使用硅铝酸盐材料和相应的结合缓冲液，能够从尿液中富集外泌体，并且采用在线酶解的方式，可直接对所富集的外泌体蛋白质组进行后续的检测分析；有效提高了尿液中蛋白质及肽段组的鉴定数目。

技术方案：为达到上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

一种尿液中外泌体的富集方法，包括如下步骤：

S1、将尿液进行低速离心，保留上清液为待测尿液样本；

S2、向待测尿液样本中加入结合缓冲液及硅铝酸盐材料，得到混悬液；

S3、将所述混悬液孵育后，进行高速离心，去除上清液，保留沉淀Ⅰ；

S4、采用清洗缓冲液重悬所述沉淀Ⅰ重悬得到重悬液，将所述重悬液高速离心后去除上清，保留沉淀Ⅱ，重复该步骤数次，最后得到包含外泌体的沉淀。

优选的，步骤S1中，所述低速离心的条件如下：离心力为200～10,000g，温度为2～26℃，时间为1～60分钟。

优选的，步骤S2中，所述结合缓冲液成分包括Tris、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸钾、磷酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钠、氯化钾、氯化钠、柠檬酸、柠檬酸钠、巴比妥酸、巴比妥钠、氢氧化钠、盐酸、EDTA、SDS、NP-40、CHAPS、吐温、Triton、PEG、乙腈、甲醇中的一种或任意组合。