[发明专利]一种小鼠肺微血管内皮细胞永生化以获得胞外囊泡的方法

说明书

本发明公开一种小鼠肺微血管内皮细胞永生化以获得胞外囊泡的方法，包括以下步骤：S1、小鼠肺微血管内皮原代细胞分离：分离新生小鼠边缘肺组织，用眼科剪刀将组织剪成小块，制备单细胞悬液，磁珠阴性选择去除CD45⁺、CD90.2⁺和CD326⁺的细胞，筛选内皮细胞集落进行体外增殖；S2、内皮细胞永生化：转染六种慢病毒并进行筛选，根据细胞的生长速率和形态选择永生化细胞株；S3、囊泡提取：采用超声离心法提取囊泡。本发明通过磁珠阴性选择和圈选手段，避免了传统磁珠阳性选择提取细胞的损害，极大改善内皮细胞的损耗；本发明通过转染慢病毒至原代细胞，构建永生化细胞，永生化细胞分泌囊泡保留了原代细胞分泌囊泡的特性，极大降低囊泡提取成本。

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，具体是一种小鼠肺微血管内皮细胞永生化以获得胞外囊泡的方法。

背景技术

肺微血管内皮细胞(PMECs)是肺泡毛细血管屏障的重要组成部分，参与气体交换。它们在肺内稳态和炎症反应中发挥重要作用。鉴于PMECs的重要作用，体外培养PMECs对于阐明肺部疾病的分子和细胞机制至关重要。小鼠肺微血管内皮细胞(pMPMECs)的研究受到细胞培养的限制。目前已经发表的分离pMPMECs最常见的方法包括：肺组织的酶解和pMPMECs对CD31或CD102磁珠免疫结合法。但是，pMPMECs的阳性磁珠选择会导致细胞早期衰老，增殖能力低。此外，磁珠的非特异性结合通常会导致肺组织中其他细胞(如成纤维细胞、平滑肌细胞、上皮细胞)的污染。

PMECs分泌的细胞外囊泡(PMEC-EVs)直接分泌到血流中，并能与循环白细胞相互作用，调节局部免疫反应。越来越多的研究表明，PMEC-EVs与炎症性肺部疾病的病理生理有关，而PMEC-EVs介导肺部疾病的具体作用机制研究尚处于探索阶段。由于pMPMECs分泌EV的能力有限，且缺乏可靠的pMPMECs细胞系。许多研究者在研究中使用脐静脉内皮细胞来源的囊泡而不是PMEC-EVs。然而，囊泡具有高度的异质性，不同来源的囊泡特性差异很大。因此，使用其他内皮细胞来源的囊泡来探索PMECs-EVs在肺部疾病中的作用可能会导致研究偏倚。

发明内容

本发明的目的在于提供一种小鼠肺微血管内皮细胞永生化以获得胞外囊泡的方法，解决了上述技术问题，避免了传统磁珠阳性选择提取细胞的损害，极大改善内皮细胞的损耗和细胞老化问题；通过转染慢病毒至原代细胞，构建永生化细胞，永生化细胞分泌囊泡保留了原代细胞分泌囊泡的特性，极大降低囊泡提取效率和成本。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种小鼠肺微血管内皮细胞永生化以获得胞外囊泡的方法，包括以下步骤：

S1、小鼠肺微血管内皮原代细胞分离

1)小鼠肺缘单细胞悬液的制备

分离小鼠肺组织，组织碎化并制备单细胞悬液；

2)小鼠肺缘单细胞培养

将单细胞悬液加入完全培养基培养至细胞融合度90％以上；

3)小鼠肺微血管内皮细胞的分离纯化

对重悬后的单细胞进行阴性选择：利用抗小鼠CD45磁珠、抗小鼠CD90.2磁珠和抗小鼠CD326磁珠分别去除淋巴细胞、成纤维细胞和上皮细胞；

S2、内皮细胞永生化

S2.1将500ul小鼠肺微血管内皮原代细胞悬液种于胶原包被的24孔板中(3×10⁴个细胞/孔)，培养24h。