[发明专利]一种小鼠肺微血管内皮细胞永生化以获得胞外囊泡的方法

权利要求书

1.一种小鼠肺微血管内皮细胞永生化以获得胞外囊泡的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、小鼠肺微血管内皮原代细胞分离

1)小鼠肺缘单细胞悬液的制备

分离小鼠肺组织，组织碎化并制备单细胞悬液；

2)小鼠肺缘单细胞培养

将单细胞悬液加入完全培养基培养至细胞融合度90％以上；

3)小鼠肺微血管内皮细胞的分离纯化

对重悬后的单细胞进行阴性选择：利用抗小鼠CD45磁珠、抗小鼠CD90.2磁珠和抗小鼠CD326磁珠分别去除淋巴细胞、成纤维细胞和上皮细胞；

S2、内皮细胞永生化

小鼠肺微血管按照比例接种入24孔板，加入慢病毒和助转染试剂后培养并进行第二轮转染，所得细胞持续传代培养，直至选出可保持形态的细胞即为永生化成功；

S3、小鼠肺微血管内皮细胞囊泡提取。

2.根据权利要求1所述的一种小鼠肺微血管内皮细胞永生化以获得胞外囊泡的方法，其特征在于，所述小鼠肺缘单细胞悬液的制备的具体操作步骤：

于无菌培养皿取出小鼠双肺，剥离脏层胸膜后剪去两侧肺缘，置于DMEM-F12基础培养基中，漂洗3次后移入5ml规格的离心管中，加入适量I型胶原酶工作液；

剪碎组织，补齐胶原酶工作液至10ml，将混合液转入C管中，并置于组织研磨仪处理；

处理后将C管置于恒温水平摇床中震荡30min，再置于组织研磨仪处理，得到混悬液通过70um尼龙滤网过滤后离心，DMEM-F12基础培养基清洗3次后加入红细胞裂解液充分裂解、终止、离心后计算活细胞数量，得到肺缘单细胞悬液。

3.根据权利要求2所述的一种小鼠肺微血管内皮细胞永生化以获得胞外囊泡的方法，其特征在于，所述小鼠肺缘单细胞培养步骤为：

将单细胞悬液加入完全培养基后重悬、调整细胞密度，置于T-75培养瓶中培养24小时后弃去上清，重新补充完全培养基，每隔两天换液、观察，直至细胞融合度至90％以上。

4.根据权利要求3所述的一种小鼠肺微血管内皮细胞永生化以获得胞外囊泡的方法，其特征在于，所述小鼠肺微血管内皮细胞的分离纯化步骤包括：

将肺缘单细胞消化重悬为单细胞悬液后，利用抗小鼠CD45磁珠、抗小鼠CD90.2磁珠和抗小鼠CD326磁珠分别去除淋巴细胞、成纤维细胞和上皮细胞；

将阴性选择剩余的细胞重新置于培养皿中培养，2天更换一次培养基并通过光镜观察，利用记号笔圈出内皮细胞集落边缘后，再利用克隆环选出内皮细胞集落。

5.根据权利要求1所述的一种小鼠肺微血管内皮细胞永生化以获得胞外囊泡的方法，其特征在于，所述步骤1)中选用出生7-14天乳鼠。

6.根据权利要求2所述的一种小鼠肺微血管内皮细胞永生化以获得胞外囊泡的方法，其特征在于，所述I型胶原酶工作液为I型胶原酶溶解于含有血清的完全培养基中。

7.根据权利要求2所述的一种小鼠肺微血管内皮细胞永生化以获得胞外囊泡的方法，其特征在于，所述红细胞裂解液加入10倍体积完全培养基终止。

8.根据权利要求3所述的一种小鼠肺微血管内皮细胞永生化以获得胞外囊泡的方法，其特征在于，所述完全培养基含有92mg/L D-valine，100IU/ml肝素，1％ECGS。

9.根据权利要求1所述的一种小鼠肺微血管内皮细胞永生化以获得胞外囊泡的方法，其特征在于，所述S2中助转染试剂选用ViralEntry；

所述慢病毒包括Lenti-SV40,Lenti-SV40T,Lenti-SV40 T(puro),Lenti-RasV12,Lenti-hTERT,Lenti-HPV-16E6/E7(puro)。

10.根据权利要求1所述的一种小鼠肺微血管内皮细胞永生化以获得胞外囊泡的方法，其特征在于，所述囊泡的提取采用超速离心法；所述内皮细胞集落通过流式细胞术、免疫荧光的手段检测。