[发明专利]一种怀牛膝根部消毒表面并分离培养其内生真菌的方法

说明书

本发明公开了一种怀牛膝根部消毒表面并分离培养其内生真菌的方法，属于真菌分离培养技术领域，包括以下步骤:选取1年生的健康怀牛膝根部，对其依次采用75％乙醇浸泡30‑50s,3‑5wt％次氯酸钠振荡洗涤6‑8min,无菌水漂洗3‑5次进行消毒处理；将经上述消毒处理后的怀牛膝根部材料的周围组织裁剪丢弃，将剩余的中部组织接种到含青霉素和链霉素的PDA培养基和怀牛膝浸提液的PDA培养基上进行培养。本发明的方法对怀牛膝组织表面进行消毒，在保证消毒效果的同时，保护内生真菌不受伤害。

技术领域

本发明属于真菌分离培养技术领域，具体涉及一种怀牛膝根部表面消毒并分离培养其内生真菌的方法。

背景技术

怀牛膝(Achyranthes bidentata Blume.)为苋科(Achyranthes)牛膝属深根系草本植物，生长于海拔200-1750米的山坡林下，主产于河南省焦作地区的武陟、沁阳、孟州、博爱、修武、温县一带(古怀庆府所辖)。该区域独特的地理地貌和气候特征，保证和保存了物种的生物遗传独立性。因此，怀庆府牛膝可能存在与其它地区、其它物种完全不同的潜在内生真菌物种资源。

从植物组织中分离得到内生真菌，是研究其功能以及多样性等性能的基础，大量关于内生真菌的研究都涉及从宿主植物中分离内生真菌。而在分离植物内生真菌的过程中，消毒方法和培养基选择是影响分离效果的关键因素。表面消毒不彻底，会造成宿主附生菌污染，而消毒剂浓度过高或者消毒时间过长，会造成内生真菌损伤严重。同时，内生真菌分离培养时的培养基选择不当，会使得内生真菌不易生长、挑取、辨认。因此，必须设计合理的表面消毒方法、检测表面消毒的效果，建立适宜的培养条件，筛选和优化培养基组成，保证植物内生真菌的分离效果。但迄今为止，国内外均未见针对怀牛膝根部表面消毒及其内生真菌分离方法的相关研究报告。

发明内容

本发明的目的在于:针对上述现有技术中存在的关于怀牛膝根部内生真菌研究的空白，以怀庆府道地药材怀牛膝为基础研究对象，提供一种能够广泛适用于怀牛膝根部表面消毒并分离培养其内生真菌的方法。

本发明采用的技术方案如下:

一种怀牛膝根部内生真菌的分离培养方法，包括以下步骤:

选取一年生健康怀牛膝，采集根部对其依次采用75％乙醇浸泡30-50s,3-5wt％次氯酸钠振荡洗涤6-8min,无菌水漂洗3-5次进行消毒处理。

进一步地，对根部依次采用75％乙醇浸泡50s,4wt％次氯酸钠振荡洗涤8min,无菌水漂洗5次进行消毒处理。

一种怀牛膝根部内生真菌的分离培养方法，包括以下步骤:

将经上述消毒处理后的材料的周围组织切剪丢弃，将剩余的中部组织接种到含青霉素和链霉素且含有怀牛膝浸提液的PDA培养基。

将上述怀牛膝根部中部组织剪成1.5-2.5mm的小段根。

上述含青霉素和链霉素的PDA培养基由PDA培养基中加入0.03-0.150g/L青霉素和0.02-0.125g/L链霉素得到，青霉素的优选量为0.08g/L，链霉素的优选量为0.06g/L。

上述青霉素和链霉素且含有怀牛膝浸提液的PDA培养基中怀牛膝浸提液的含量为80-120mL/L,青霉素的含量为0.03-0.150g/L，链霉素的含量为0.02-0.125g/L；怀牛膝浸提液含量优选为90mL/L,青霉素的优选量为0.08g/L，链霉素的优选量为0.06g/L；其中怀牛膝浸提液为水提液，将200怀牛膝整株切碎为约1*3cm的小块，加入1000mL蒸馏水中，加热煮沸30min，再补充蒸馏水至1L得到。

综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是: