[发明专利]一种诱导墨兰根状茎增殖的培养基及其制备方法

说明书

本发明公开了一种诱导墨兰根状茎增殖的培养基的制备方法，包括以下步骤:通过向4‑羟基香豆素的乙酸乙酯溶液中，先加入三乙胺，再滴加三氯氧磷的乙酸乙酯溶液，反应、抽滤，滤液用氢氧化钾调节pH至中性，得到磷酸酯钾盐类主诱导剂；然后向磷酸酯钾盐类主诱导剂中添加以6‑苄氨基嘌呤、氯化胆碱为原料的副诱导剂，将主诱导剂与副诱导剂混匀，得到培养基诱导剂；将草炭与沙土混合，灭菌、冷却，得到复合基质；将诱导剂和复合基质在无菌条件下混匀后，加入到含有中药提取物的琼脂中，得到培养基，本发明在磷酸酯钾盐类主诱导剂和6‑苄氨基嘌呤、氯化胆碱副促进剂的配合下，对墨兰的根状茎增殖具有很好的促进作用，大大提高墨兰根茎的增殖系数。

技术领域

本发明涉及墨兰种植技术领域，具体涉及一种诱导墨兰根状茎增殖的培养基及其制备方法。

背景技术

墨兰，兰科兰属地生植物；生于海拔300-2000米的林下、灌木林中或溪谷旁湿润但排水良好的荫蔽处。

中国专利CN106035090B公开了通过培养基的设计，实现春兰根状茎的快速繁殖和分化。其过程包括将无菌春兰根状茎接种至增殖培养基中，增殖9倍，转至分化培养基中，15天后有幼芽的分化，获得春兰试管苗。本发明方法使用的两种培养基，所用成分均为常规培养基成分，但却可以大大减少根状茎和培养基的褐化率；

现有技术中，墨兰在生长过程中，其根状茎增殖率不高，主要靠分株繁殖，但繁殖周期长而且繁殖率低，不能形成规模种植的问题。

发明内容

本发明的目的就在于解决上述背景技术的问题，而提出一种诱导墨兰根状茎增殖的培养基及其制备方法，在磷酸酯钾盐类主诱导剂和6-苄氨基嘌呤、氯化胆碱副促进剂的配合下，对墨兰的根状茎增殖具有很好的促进作用，大大提高墨兰根茎的增殖系数。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种诱导墨兰根状茎增殖的培养基的制备方法，包括以下步骤:

步骤一、配制诱导剂：通过向4-羟基香豆素的乙酸乙酯溶液中，先加入三乙胺，再滴加三氯氧磷的乙酸乙酯溶液，反应2h，抽滤，滤液用氢氧化钾调节pH至中性，得到磷酸酯钾盐类主诱导剂；然后向磷酸酯钾盐类主诱导剂中添加以6-苄氨基嘌呤、氯化胆碱为原料的副诱导剂，将主诱导剂与副诱导剂混匀，得到培养基诱导剂；

步骤二、配制复合基质：将草炭与沙土混合，灭菌、冷却，得到复合基质；

步骤三、将诱导剂和复合基质在无菌条件下混匀后，加入到含有中药提取物的琼脂中，得到培养基。

中药提取物的制备工艺包括以下步骤：

步骤1：取30g玉竹和紫参，用300-500mL水溶解后，加入800-1000mL无水乙醇，以5000r/min的转速进行离心沉淀，倾去上清液，再用100-120mL的乙醇洗涤两次，离心后取沉淀物进行干燥，得到初品；

步骤2：按照质量比1:10将初品与去离子水混合后，过纤维素柱，用蒸馏水以50mL/h的流速洗脱后，收集，再通过旋蒸去除溶剂，得到中药提取物；

其中，玉竹与紫参的质量比为1-2:1-2。

作为本发明进一步的方案：在步骤一中，4-羟基香豆素的乙酸乙酯溶液的质量分数为16％，三氯氧磷的乙酸乙酯溶液的质量分数为50％。

作为本发明进一步的方案：在步骤一中，4-羟基香豆素的乙酸乙酯溶液、三乙胺和三氯氧磷的乙酸乙酯溶液的质量比为110-130:8-12:40-50。

作为本发明进一步的方案：在步骤一中，反应温度控制在-5-0℃。

作为本发明进一步的方案：在步骤一中，pH调节后，通过先旋蒸除去溶剂和水，再烘干得到粗品，粗品经柱层析进行后处理。