[发明专利]一种基于CRISPR-Cpf1的高效基因编辑系统的构建

说明书

本发明公开了一种基于CRISPR‑Cpf1的高效基因编辑系统的构建，属于基因工程技术领域。本发明首先表征了来自于F.novicida的Cas蛋白Cpf1，将FnCpf1整合到枯草芽孢杆菌基因组的lacA位点。靶向不同基因的crRNA，将该crRNA置于枯草芽孢杆菌来源的强组成型启动子Pveg的下游，用于高强度表达对应的crRNA。通过选用不同靶向基因的crRNA，该基因组编辑方法被验证。菌落PCR结果显示，sacA基因，ligDV基因以及pps基因簇均能够实现高效的敲除。同时，为了验证该系统的敲入效率，外源基因sfGFP被高效敲除到sacA位点。为了进一步验证该系统的多基因敲除效率，本发明选择了sacA和aprE作为靶标，菌落PCR结果显示出了高效的敲除效率。

技术领域

本发明涉及一种基于CRISPR-Cpf1的高效基因编辑系统的构建，属于基因工程技术领域。

背景技术

枯草芽孢杆菌是广泛应用于蛋白质外源表达的革兰氏阳性菌株，也是基础研究的最佳底盘微生物，因此在代谢工程和合成生物学领域有着广泛的应用。目前，在枯草芽孢杆菌中已经建立起广泛用于基因组编辑的工具-Cre/loxP。然而这类编辑工具属于引入外源抗性基因作为正向筛选的标志，这是不符合食品工业要求的。尽管利用该系统已经能通过引入翻转酶来将抗性基因消除，然而这个操作过程是繁琐的。因此，构建高效的，便携的基因组编辑工具对于构建更高版本的枯草芽孢杆菌，并将该底盘细胞作为微生物细胞工厂有很大意义。

近期，基于CRISPR/Cas9的基因组编辑工具在枯草芽孢杆菌中已经被开发，该工具能够实现单基因的删除。然而该系统的删除效率有待提高，并且基因的敲入和大片段的删除效率没有被验证。更重要的是，该系统也没有提供一种多基因删除的策略。多基因删除对于构建底盘细胞非常重要，因为这能够大大缩短构建的周期。因此，提供一种高效的，快速便携的基因组编辑工具，对于枯草芽孢杆菌作为代谢细胞工厂和合成生物学研究平台具有重要意义。

发明内容

本发明提供了一种基因编辑元件，所述元件包括来源于F.novicida的Cpf1、crRNA和表达载体组成。

在一种实施方式中，以pB-Pveg-sfGFP为表达载体。

在一种实施方式中，所述Cpf1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明提供了一种基因编辑的方法，利用所述的元件编辑靶向基因。

在一种实施方式中，将所述Cpf1整合至枯草芽孢杆菌的基因组上，将靶向基因的crRNA整合至表达载体pB-Pveg-sfGFP得到重组表达载体，将重组表达载体转入整合了Cpf1的枯草芽孢杆菌中，得到重组枯草芽孢杆菌，将重组枯草芽孢杆菌在培养体系中培养，实现对靶向基因的敲除或敲入。

在一种实施方式中，将所述Cpf1整合至枯草芽孢杆菌的基因组上lacA位点。

在一种实施方式中，所述Cpf1整合至木糖启动子下游，基因编辑过程受木糖调控。

在一种实施方式中，在敲入目的基因并敲除靶向基因时，将靶向基因的crRNA克隆至pB-Pveg-sfGFP表达载体中sfGFP的位置(替换掉sfGFP基因)，再将目的基因整合至含有靶向基因的crRNA的表达载体构建得到重组表达载体，将重组表达载体转入整合了Cpf1的枯草芽孢杆菌中，得到重组枯草芽孢杆菌。

在一种实施方式中，所述靶向基因为枯草芽孢杆菌本身所表达的基因，包括但不限于sacA、ligDV、pps。

在一种实施方式中，将所述重组枯草芽孢杆菌在培养基中培养至OD₆₀₀为0.4±0.1，加入木糖诱导表达12～20h。

本发明提供了所述元件在基因编辑中的应用。

在一种实施方式中，所述应用包括但不限于单基因的敲除、多基因的敲除或基因的敲入。