[发明专利]以5-羟基β-吲哚基丙氨酸为底物生物法合成N-乙酰基-5-甲氧基色胺的方法

说明书

本发明提供了以5‑羟基β‑吲哚基丙氨酸为底物生物法合成N‑乙酰基‑5‑甲氧基色胺的方法。本发明提供了N‑乙酰基‑5‑甲氧基色胺高产菌株，其用于以5‑羟基β‑吲哚基丙氨酸为底物生物法合成N‑乙酰基‑5‑甲氧基色胺的方法，N‑乙酰基‑5‑甲氧基色胺的合成产量高。进一步通过5‑羟色胺产N‑乙酰‑5‑羟色胺途径关键酶基因AANAT的筛选和N‑乙酰‑5‑羟色胺产N‑乙酰基‑5‑甲氧基色胺途径关键酶基因COMT的筛选及组合筛选，显著提升了生物合成N‑乙酰基‑5‑甲氧基色胺的产量。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种新的合成N-乙酰基-5-甲氧基色胺方法及其应用。

背景技术

N-乙酰基-5-甲氧基色胺主要是哺乳动物松果体腺分泌的重要吲哚类神经激素，吲哚以其独特的化学结构，在化学合成医药中降压药、抗组胺药、解热镇痛剂等都有它的身影，许多生物碱、高效植物生长调节剂、染料等领域都系吲哚类衍生物。N-乙酰基-5-甲氧基色胺能够改善动物机体睡眠质量。随着动物年龄的增长，N-乙酰基-5-甲氧基色胺的分泌量逐渐下降。现在越来越多的研究表明N-乙酰基-5-甲氧基色胺除了能够治疗失眠症外，还具有抗氧化、抗衰老、调节免疫、抗癌等多种生理功能。

N-乙酰基-5-甲氧基色胺系天然药物产物成分，产生的副作用甚微，与目前的广泛使用的镇静安眠药相比较，在毒副作用、剂量、成瘾截断方面优势明显。故N-乙酰基-5-甲氧基色胺的作用疗效和市场价值举足轻重、不可替代。

目前，N-乙酰基-5-甲氧基色胺的获得主要有生物提取和化学合成两大类。由于动植物中天然存在的N-乙酰基-5-甲氧基色胺含量很少，并且提取原料来源有限，提取成本居高不下，工业应用受到诸多限制。

相比化学合成，生物合成具有对环境友好，能耗低，绿色环保等优点。随着合成生物学的发展，越来越多的化合物实现了生物绿色生产。提供能够高产量生物合成N-乙酰基-5-甲氧基色胺的工程菌及合成方法意义重大。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为提供N-乙酰基-5-甲氧基色胺高产菌株、构建以及以5-羟基β-吲哚基丙氨酸为底物生物法合成N-乙酰基-5-甲氧基色胺的方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

提供一种以5-羟基β-吲哚基丙氨酸为底物生物法合成N-乙酰基-5-甲氧基色胺的方法，包括以下步骤：

1)利用所述的合成N-乙酰基-5-甲氧基色胺蛋白编码基因或能够表达合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸蛋白编码基因的重组基因工程菌，以5-羟基β-吲哚基丙氨酸为底物，生物发酵合成N-乙酰基-5-甲氧基色胺，所述的能够表达合成N-乙酰基-5-甲氧基色胺蛋白编码基因包括5-羟基β-吲哚基丙氨酸产5-羟色胺途径关键酶基因DDC；5-羟色胺产N-乙酰-5-羟色胺途径关键酶基因AANAT、ACS；N-乙酰-5-羟色胺产N-乙酰基-5-甲氧基色胺途径关键酶基因COMT、MAT；

2)从1)的体系中分离得到N-乙酰基-5-甲氧基色胺。

按上述方案，5-羟基产N-乙酰-5-羟色胺途径关键酶基因AANAT的核苷酸序列如SEQ ID NO:2-10中任一序列所示；N-乙酰-5-羟色胺产N-乙酰基-5-甲氧基色胺途径关键酶基因COMT的核苷酸序列如SEQ ID NO:12-18中任一序列所示。

按上述方案，5-羟基β-吲哚基丙氨酸产5-羟色胺途径关键酶基因DDC的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

5-羟色胺产N-乙酰-5-羟色胺途径关键酶基因ACS的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示；

N-乙酰-5-羟色胺产N-乙酰基-5-甲氧基色胺途径关键酶基因MAT基因核苷酸序列如SEQ ID NO：19所示。