[发明专利]一种基于乏氧响应的铂超纳米粒子的尿液检测方法和应用

说明书

本发明公开了一种基于乏氧响应的铂超纳米粒子的尿液检测方法及其应用。本发明的铂超纳米粒子PNCA由氨基化后的超小的铂纳米簇与乏氧响应的4,4’‑二羧酸偶氮苯azo通过EDC/NHS反应共价连接而成，并在其表面包裹上一层透明质酸HA后，该纳米粒子可特异性地靶向肿瘤部位。之后，在肿瘤部位乏氧环境还原酶的作用下，PNCA纳米粒子可还原降解为许多小的PtNCs，重新进入血液循环，由于其粒径小于肾脏可清除的临界值5.5nm，因此可从肾脏排泄到尿液中进行疾病状态的检测。由于PNCA纳米粒子的优异的乏氧响应效果以及PtNCs高效的肾脏清除效果，使得本发明在活体应用上，优势明显。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于乏氧响应的铂超纳米粒子的尿液检测方法和应用。

背景技术

癌症的早期诊断可以通过手术和放疗等局部治疗干预措施对原发肿瘤进行有效治疗。目前的癌症的早期诊断策略主要依赖于成像技术以及分子诊断分析。成像技术，如磁共振成像(MRI)和计算机断层扫描(CT)，可以呈现高空间分辨率以及高密度分辨率的三维图像，仍然是临床检测癌症的标准。但是，成像技术价格高昂且灵敏度比较低。目前分子诊断是癌症早期诊断的主要方法，但是由于生物标志物在肿瘤部位的脱落率比较低而且经过血液循环巨大的稀释，使得检测循环内源性生物标志物的策略面临早期疾病固有的敏感性的限制。与其寻找内源性生物标记物，一个有希望的策略是设计外源性标志物，可以克服内源性生物标志物丰度不足的缺陷，专门探测病变组织的存在。通过以铂超纳米粒子作为外源性标志物与非侵入性的尿液检测手段相结合，进行早期疾病的检测是一种很有前途的策略。

发明内容

为了构建基于乏氧响应的铂超纳米粒子用于肿瘤检测的平台，本发明将表面修饰了巯基乙胺的铂纳米簇(PtNCs，1～2nm)通过EDC/NHS活化的4,4’-二羧酸偶氮苯(azo)上的羧基连接成铂超纳米粒子(PNCA)。在肿瘤乏氧环境中，N＝N键被破坏，PNCA发生解离重新释放出超小的PtNCs进入血液循环，经过肾脏代谢排泄到尿液中，通过收集尿液对里面的PtNCs的含量进行检测，即可对疾病状态进行读出。

为了实现上述发明目的，本发明涉及的乏氧响应的铂超纳米粒子用于肿瘤的尿液检测的方案如下：本发明的一种基于乏氧响应的铂超纳米粒子的制备方法，包括如下步骤：

(1)将超小的铂纳米簇PtNCs表面进行氨基化，然后借助乏氧响应的4,4’-二羧酸偶氮苯azo与铂纳米簇PtNCs共价连接得到铂超纳米粒子PNCA，其中4,4’-二羧酸偶氮苯azo上的羧基是通过EDC/NHS反应活化后与PtNCs进行共价连接；

(2)并在静电吸附的作用下，在PNCA纳米粒子最外层包裹上可以特异性靶向肿瘤细胞表面CD44受体的透明质酸HA，制得PNCAH铂超纳米粒子。

进一步地，在步骤(1)中，所述的铂纳米簇PtNCs为利用六水合氯铂酸和柠檬酸三钠通过一锅热法合成，其中柠檬酸三钠在反应中起到还原剂和保护剂的角色，反应中用到的六水合氯铂酸的浓度为1mM，柠檬酸三钠的浓度为3.88mM，反应温度为100℃。

进一步地，在步骤(1)中，所述的氨基化过程采用的分子为巯基乙胺，同时氨基化的过程中还加入了巯基乙醇防止铂纳米簇发生聚集，氨基化反应时巯基乙胺的浓度为0.4mM，巯基乙醇的浓度为0.6mM，反应时间为3h。

更进一步地，在步骤(1)中，所述的EDC/NHS活化过程，EDC的中文名为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，NHS的中文名为N-羟基琥珀酰亚胺，EDC反应时的浓度是30mM，NHS反应时的浓度为3.3mM，活化时间为2h；所述的铂纳米簇PtNCs与4,4’-二羧酸偶氮苯azo的质量比为90-100:1-6，反应时间为12h。

进一步地，在步骤(2)中，所述的HA的包裹过程，HA与加入的PNCA纳米粒子的质量比为1:2，反应时间为2h。