[发明专利]高效液相色谱法测定利伐沙班中潜在基因毒性杂质的方法

说明书

本发明公开了一种高效液相色谱法测定利伐沙班中潜在基因毒性杂质的方法，包括：配制对照品溶液、供试品溶液，对对照品溶液、供试品溶液进行HPLC检测，HPLC检测的色谱条件为：采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，流动相A为8～12mmol/L辛烷磺酸钠溶液，含0.08～0.12％V/V磷酸，流动相B为甲醇和乙腈的体积比为95:5～85:15的混合溶剂，梯度洗脱，流速为0.8～1.2mL/min，检测波长为220～240nm；采用外标法测定利伐沙班中4‑(4‑吗啉基)‑苯胺的含量。本发明方法用于检测利伐沙班中的基因毒性杂质4‑(4‑吗啉基)‑苯胺，分离效率高、分析速度快、检测灵敏度高，且检测量更低。

技术领域

本发明属于物质检测技术领域，涉及一种高效液相色谱法(HPLC)测定利伐沙班中潜在基因毒性杂质的方法，尤其是涉及一种高效液相色谱法测定利伐沙班中杂质4-(4-吗啉基)-苯胺的方法。

背景技术

伐沙班片为一种抗血栓药物，它不需要抗凝血酶Ⅲ参与，可直接拮抗游离和结合的Xa因子。利伐沙班为利伐沙班片中主要活性成分，通过测定利伐沙班潜在基因毒性杂质，可以较好的反映利伐沙班片的质量。因此，建立一种测定利伐沙班中的潜在基因毒性杂质方法，可以更好的控制利伐沙班的质量和产品的稳定性。

发明内容

本发明的目的在于建立一种高效液相色谱法测定利伐沙班中潜在基因毒性杂质4-(4-吗啉基)-苯胺的方法，以更好的控制利伐沙班的质量和产品的稳定性。

由于4-(4-吗啉基)-苯胺极性较大，采用0.1％磷酸溶液为流动相A时，4-(4-吗啉基)-苯胺保留时间2～5min，容易被溶剂峰干扰而不能准确采集到数据，因此发明人考虑添加离子对试剂改变4-(4-吗啉基)-苯胺的保留时间。发明人筛选了戊烷磺酸钠、己烷磺酸钠、庚烷磺酸钠、辛烷磺酸钠和葵烷磺酸钠等阳离子对试剂，在离子对试剂同等浓度条件下，离子对的链越长4-(4-吗啉基)-苯胺的保留时间相对越长，但并非保留时间越长越好，而是需要综合考虑检测成本、检测时间、空白溶剂干扰、回收率和分离度等方面，从而选用辛烷磺酸钠作为离子对添加剂，确认采用辛烷磺酸钠溶液(8～12mmol/L浓度，含0.08～0.12％V/V磷酸)作为流动相A。除去离子对试剂的影响，有机相对峰型、灵敏度和保留时间也有影响，发明人考察了甲醇、乙腈、甲醇-乙腈(V/V)混合溶剂的影响。采用甲醇作为有机相时，甲醇的比例在5％～15％时，4-(4-吗啉基)-苯胺的保留时间在20min之后，但是峰型较宽，灵敏度不符合要求；甲醇的比例在15％～35％时，4-(4-吗啉基)-苯胺的保留时间在20min之前，峰型较好，灵敏度符合要求，但是空白溶剂和供试品溶液干扰。采用乙腈做有机相时，由于乙腈的洗脱能力较甲醇强，乙腈的比例在5％～15％时，4-(4-吗啉基)-苯胺的保留时间在10～15min，峰型好，灵敏度符合要求，但是受空白溶剂和供试品溶液干扰。综合考虑甲醇和乙腈的洗脱能力，对峰型和灵敏度的影响，选用甲醇-乙腈(95:5～85:15V/V)混合溶剂作为流动相B。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种高效液相色谱法测定利伐沙班中潜在基因毒性杂质的方法，包括：

配制对照品溶液：取4-(4-吗啉基)-苯胺对照品，采用二甲基亚砜配制成每1mL二甲基亚砜含0.125μg～0.5μg4-(4-吗啉基)-苯胺的对照品溶液；

配制供试品溶液：称取利伐沙班，采用二甲基亚砜配制成每1mL二甲基亚砜含2.5mg～10mg利伐沙班的供试品溶液；

分别对对照品溶液、供试品溶液进行HPLC检测，所述HPLC检测的色谱条件为：采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，流动相包括流动相A和流动相B，所述的流动相A为8～12mmol/L辛烷磺酸钠溶液，含0.08～0.12％V/V磷酸，所述的流动相B为甲醇和乙腈的体积比为95:5～85:15的混合溶剂，洗脱方式为梯度洗脱，流速为0.8～1.2mL/min。，检测波长为220～240nm；

所述的梯度洗脱的条件为：