[发明专利]寻找已知启动子序列结合未知蛋白的特异性引物及方法

说明书

本发明涉及一种寻找已知启动子序列结合未知蛋白的特异性引物及方法，属于分子生物学技术领域，所述的特异性引物序列如下：AGAGCATTGCGACCAGCGGCTTGAC。本发明还提供利用上述通用引物寻找已知启动子序列结合未知蛋白(转录因子)的方法，所述方法具体包含制备含有生物素标记的启动子片段，磁珠预处理，制备探针—磁珠复合物，提取组织的活性总蛋白，DNA pulldown和SDS‑PAGE垂直电泳检测。本发明通过设计生物素标记的特异性通用引物，降低了DNA pulldown实验成本。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种寻找已知启动子序列结合未知蛋白的特异性引物及方法。

背景技术

DNA相互作用蛋白在包括基因调控在内的许多生物过程中发挥着重要作用。这些蛋白质与DNA序列结合或与其他DNA结合蛋白相互作用以调节基因表达。DNA相互作用蛋白的鉴定有助于理解其在基因调控中的作用，并有助于发现调控机制。

转录因子与启动子区域上的特异性调控元件的结合在基因表达和调控中至关重要。激活转录这一活动需要与DNA结合的反式激活子募集转录共激活因子或抑制子，以及众多与基础转录因子相互作用的相关蛋白，因而分析这些与DNA结合的大型蛋白质复合物是阐明调节基因表达机制的重要步骤。

目前已知的DNA-蛋白互作技术主要包括：DNA pulldown、CHIP、EMSA、双荧光素酶、酵母单杂等。

DNA pull down得以成功实施的基础是DNA短片段上含有对DNA结合蛋白高亲和力的位点，这种DNA短片段可以是天然存在的也可以是由寡核苷酸形成的。已知生物素/链霉亲和素纯化系统中生物素与链霉亲和素可以形成紧密且基本不可逆的复合物，将生物素化的核苷酸分子掺入DNA片段的末端(即探针)，再使用该DNA片段与beads共孵育，利用生物素与亲和素的高亲和力，以获取含有生物素标记的DNA片段。再向DNA-磁珠复合物中加入活性蛋白，遂形成包含蛋白质、DNA、磁珠、以及DNA-蛋白质-磁珠的混合物。借助磁力架对磁珠的吸引力，对混合物进行反复洗涤，最后用高盐缓冲液将目标蛋白质从剩余的DNA-蛋白质-磁珠中洗脱。

相较于EMSA，DNA pull down的优点是可以同时分析复合物中的大量蛋白质。

Wu-Guo Deng等人将环氧合酶-2启动子作为探针，与核提取物孵育，最后通过免疫印迹评估复合物中的蛋白质，检测到一系列转录因子。

为了探究蛋白混合物中的结合蛋白，质谱技术可以对蛋白质复合物进行更加深入的定量分析。

Diem Hong Tran等人将DNA pull down与二维凝胶电泳和质谱分析相结合，鉴定了六种与人D-氨基酸氧化酶基因5’侧翼区域结合的蛋白质。

但是，利用DNA pulldown方法来研究启动子与转录因子相互作用以阐明基因表达调控机制的相关研究甚少。

发明内容

本发明是为了解决现有的启动子转录因子互作技术上所存在的种种问题，提供一种可节省人力物力、降低成本的DNA pulldown方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种寻找已知启动子序列结合未知蛋白的特异性引物，所述的特异性引物序列如下：AGAGCATTGCGACCAGCGGCTTGAC。

本发明还提供利用上述通用引物寻找已知启动子序列结合未知蛋白(转录因子)的方法，所述方法具体包含以下步骤：

步骤一、制备含有生物素标记的启动子片段：设计带有生物素标记的特异性通用引物，使用巢式PCR结合降落PCR的方法获得带有生物素标记的探针；

步骤二、磁珠预处理：使用Wash/Binding Buffer洗涤磁珠三次；