[发明专利]寻找已知启动子序列结合未知蛋白的特异性引物及方法

权利要求书

1.一种寻找已知启动子序列结合未知蛋白的特异性引物，其特征在于所述的特异性引物序列如下：AGAGCATTGCGACCAGCGGCTTGAC。

2.利用权利要求1所述通用引物寻找已知启动子序列结合未知蛋白的方法，其特征在于所述方法具体包含以下步骤：

步骤一、制备含有生物素标记的启动子片段：设计带有生物素标记的特异性通用引物，使用巢式PCR结合降落PCR的方法获得带有生物素标记的探针；

步骤二、磁珠预处理：使用Wash/Binding Buffer洗涤磁珠三次；

步骤三、制备探针—磁珠复合物：将步骤一制备的带有生物素标记的启动子片段和步骤二中预处理的磁珠结合；

步骤四、提取组织的活性总蛋白；

步骤五、DNA pulldown：将步骤四制备的活性总蛋白加入到步骤三制备的探针—磁珠复合物中，加入蛋白酶抑制剂及DTT 4℃共孵育5h；

步骤六、SDS-PAGE垂直电泳检测：将步骤五中的孵育产物置于磁力架上静置2min以上，收集磁珠，向磁珠中加入冰冷PBS洗涤，收集蛋白—探针—磁珠复合物，向蛋白—探针—磁珠复合物中加入PBS和蛋白上样缓冲液，95℃加热5min，置于磁力架上静置2min以上，取上清进行SDS-PAGE垂直电泳检测。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述步骤一制备含有生物素标记的启动子片段的方法为：选取靶基因转录起始位点上游2000bp及下游500bp，在此区域内设计外引物，用PCR技术扩增以提高模板质量；再以一次PCR产物为模板，设计内引物，利用生物素标记的特异性通用引物，用降落PCR技术进行二次扩增，得到特异的含有生物素标记的启动子片段。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述步骤二磁珠预处理的方法为：用Wash/Binding Buffer洗涤链霉亲和素标记的磁珠，置于磁力架上静置2min以上，去除Wash/Binding Buffer洗涤液，重复三次；所述Wash/Binding Buffer配方为：0.5M NaCl、20mM pH＝7.5的Tris-HCl、1mM EDTA。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述步骤三制备探针—磁珠复合物的方法为：取步骤一中制备的生物素标记的启动子片段，加入到步骤二预处理的磁珠中，并涡旋以悬磁珠，4℃过夜，将过夜后装有探针—磁珠复合物的离心管置于磁力架上，静置2min以上，去上清，收集探针—磁珠复合物，向探针—磁珠复合物中加入Wash/Binding Buffer洗涤三次，每次洗涤结束后，均置于磁力架上静置2min以上，收集离心管壁上被吸附的探针—磁珠复合物，向最后一次洗涤结束后收集的探针—磁珠复合物中加入Elution Buffer，得探针—磁珠复合物；所述Elution Buffer配方为：10mM pH＝7.5的Tris-HCl、1mM EDTA。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述步骤六向磁珠中加入冰冷PBS洗涤三次。