[发明专利]一种通过人工接种菰黑粉菌使雄茭产生正常茭白的方法

说明书

本发明提供了一种通过人工接种菰黑粉菌使雄茭产生正常茭白的方法，包括如下步骤：步骤一、从单季茭白分离、培养出菰黑粉菌单倍体MT菌株；步骤二、以菰黑粉菌交配信息素肽基因的引物组进行多重PCR验证分离单倍体菌株的交配型；步骤三、将验证出交配型基因不同的单菌落经培养、筛选出产生白色菌丝的单倍体菌株；步骤四、对芽萌发的双季茭白雄茭进行接种，接种的菌液采用所述产生白色菌丝的单倍体菌株培养得到，接种后经黑暗培养、光照/黑暗交替培养至雄茭正常孕茭。本发明将不同的菌株和不同的茭白品种结合，加快了茭白的育种进程，有望在较短时间内育成一大批符合地域要求。

技术领域

本发明涉及茭白育种技术领域，尤其涉及一种通过人工接种菰黑粉菌使雄茭产生正常茭白的方法。

背景技术

茭白是我国重要的水生蔬菜之一，随着农业产业结构的调整，茭白栽培面积呈逐年扩大的趋势，已成为长江流域多地的支柱产业和地理标志产品。茭白品种选育是一个无性系种墩筛选过程，费时费力；且无性繁殖植物遗传变异频率较低，因此茭白新品种选育迄今尚无实质性突破。但是茭白是菰受到菰黑粉菌侵染茎基部数节膨大产生的白色肉质茎，菰黑粉菌的繁殖单位数量极大，发生变异的绝对数容易超过一般植物，导致茭白分株繁殖后代差异大，常有脱离菰黑粉菌侵染的茎尖组织不膨大的“雄茭”和嫩茎内充满灰黑粉末的“灰茭”的产生，二者无经济价值，且年发生率高，造成巨大的经济损失。研究发现，与正常茭白相比，雄茭长势较旺，分蘖多，同时茭白品种之间差异形成与其体内的菰黑粉菌的存在密切相关，如能通过从茭白体内分离的菰黑粉菌的不同菌株和不同品种雄茭进行组合人工接种，使其人工孕茭，有望加快育种进程，减少变异率和增加产量，培育出新的茭白品种。但目前尚未见到通过人工接种不同品种的菰黑分菌使雄茭产生正常茭白的方法。

发明内容

本发明旨在解决现有技术中存在的技术问题。为此，本发明提供一种通过人工接种菰黑粉菌使雄茭产生正常茭白的方法，目的是从茭白体内分离的菰黑粉菌的不同菌株和不同品种雄茭进行组合人工接种，加快茭白的育种进程。

基于上述目的，本发明提供了一种通过人工接种菰黑粉菌使雄茭产生正常茭白的方法，包括如下步骤：

步骤一、从单季茭白分离、培养出菰黑粉菌单倍体MT菌株；

步骤二、以菰黑粉菌交配信息素肽基因的引物组进行多重PCR验证分离单倍体菌株的交配型；

步骤三、将验证出交配型基因不同的单菌落经培养、筛选出产生白色菌丝的单倍体菌株；

步骤四、对芽萌发的双季茭白雄茭进行接种，接种的菌液采用所述产生白色菌丝的单倍体菌株培养得到，接种后经黑暗培养、光照/黑暗交替培养至雄茭正常孕茭。

所述步骤一中单季茭白分离、培养出菰黑粉菌单倍体MT菌株的方法包括如下步骤：挑取成熟老化期正常茭白YD-3号肉质茎内产生的黑色冬孢子堆，经无菌水稀释、固体PDA培养基培养、冲洗平板制备孢子悬浮液、显微镜观察已萌发成杆状的孢子数目在5个以下，在显微镜下挑取单个孢子点在新的PDA培养基上进行扩大培养得到。

所述固体PDA培养基培养的温度为28℃，培养时间为2d。

所述引物组包括Pra1-F/R引物、Pra2-F/R引物和Pra3-F/R引物，Pra1-F/R 引物的正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物核苷酸序列如 SEQ ID NO.4所示；Pra2-F/R引物的正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，反向引物核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示；Pra3-F/R引物的正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

所述多重PCR的反应体系为：ddH₂O 6μL，2×M5 Taq PCR Mix 10μL，模板1μL，Pra1-F/R、Pra2-F/R、Pra3-F/R引物各0.5μL；反应程序：94℃预变性5min，94℃30s、56℃30s、72℃1min，30个循环，72℃延伸7min。