[发明专利]一种通过人工接种菰黑粉菌使雄茭产生正常茭白的方法

权利要求书

1.一种通过人工接种菰黑粉菌使雄茭产生正常茭白的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、从单季茭白分离、培养出菰黑粉菌单倍体MT菌株；

步骤二、以菰黑粉菌交配信息素肽基因的引物组进行多重PCR验证分离单倍体菌株的交配型；

步骤三、将验证出交配型基因不同的单菌落经培养、筛选出产生白色菌丝的单倍体菌株；

步骤四、对芽萌发的双季茭白雄茭进行接种，接种的菌液采用所述产生白色菌丝的单倍体菌株培养得到，接种后经黑暗培养、光照/黑暗交替培养至雄茭正常孕茭。

2.根据权利要求1所述通过人工接种菰黑粉菌使雄茭产生正常茭白的方法，其特征在于，所述步骤一中单季茭白分离、培养出菰黑粉菌单倍体MT菌株的方法包括如下步骤：挑取成熟老化期正常茭白YD-3号肉质茎内产生的黑色冬孢子堆，经无菌水稀释、固体PDA培养基培养、冲洗平板制备孢子悬浮液、显微镜观察已萌发成杆状的孢子数目在5个以下，在显微镜下挑取单个孢子点在新的PDA培养基上进行扩大培养得到。

3.根据权利要求2所述通过人工接种菰黑粉菌使雄茭产生正常茭白的方法，其特征在于，所述固体PDA培养基培养的温度为28℃，培养时间为2d。

4.根据权利要求1所述通过人工接种菰黑粉菌使雄茭产生正常茭白的方法，其特征在于，所述引物组包括Pra1-F/R引物、Pra2-F/R引物和Pra3-F/R引物，Pra1-F/R引物的正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；Pra2-F/R引物的正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；Pra3-F/R引物的正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，反向引物核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示。

5.根据权利要求1所述通过人工接种菰黑粉菌使雄茭产生正常茭白的方法，其特征在于，所述多重PCR的反应体系为：ddH₂O 6μL，2×M5 Taq PCR Mix 10μL，模板1μL，Pra1-F/R、Pra2-F/R、Pra3-F/R引物各0.5μL；反应程序：94℃预变性5min，94℃30s、56℃30s、72℃1min，30个循环，72℃延伸7min。

6.根据权利要求1所述通过人工接种菰黑粉菌使雄茭产生正常茭白的方法，其特征在于，所述步骤三中交配型基因不同的单菌落分别为UeYD-3MT10、UeYD-3MT12和UeYD-3MT24，通过挑取PCR验证出交配型基因不同的单菌落UeYD-3MT10、UeYD-3MT12和UeYD-3MT24转接于PDB培养基培养，之后取不同交配型基因菌液两两混匀进行配对，经PDA平板培养后观察配对菌株是否产生白色菌丝。

7.根据权利要求6所述通过人工接种菰黑粉菌使雄茭产生正常茭白的方法，其特征在于，所述步骤四中接种的菌液是将产生白色菌丝的单倍体菌株培养活化后，刮取UeYD-3MT10、UeYD-3MT12和UeYD-3MT24长出的单菌落边缘，分别转接于PDB培养基中，经培养、离心、洗涤、无菌水重悬后，分别将UeYD-3MT10和UeYD-3MT24、以及UeYD-3MT12和UeYD-3MT24的两种菌液1:1等量混合得到。

8.根据权利要求1所述通过人工接种菰黑粉菌使雄茭产生正常茭白的方法，其特征在于，所述步骤四中双季茭白雄茭的芽萌发方法是挖取双季茭白YD-10雄茭地下部产生的带顶芽游茭进行移栽，移栽后平铺于基质表面，覆盖浅水层，于室温23～28℃培养至芽萌发。

9.根据权利要求1所述通过人工接种菰黑粉菌使雄茭产生正常茭白的方法，其特征在于，所述步骤四中双季茭白雄茭进行接种的方法是双季茭白雄茭芽萌发10d时，将苗连完整根系挖出或剥去苗茎基部附近基质，剥去雄茭苗最外面一层叶鞘，在靠近雄茭生长锥的茎基部注射菌液，直至在苗的中心叶位置，有多余菌液溢出为止。

10.根据权利要求1所述通过人工接种菰黑粉菌使雄茭产生正常茭白的方法，其特征在于，所述黑暗培养是在24-28℃黑暗培养3d；光照/黑暗交替培养是先在温室中栽培，光照时间为16-18h光照/6-8h黑暗，当验证菰黑粉菌成功接种于雄茭苗中后，再将接种成功的雄茭苗，放置于8-12h黑暗/12-16h光照，15-18℃黑暗/25-28℃光照的环境中生长30d；然后进行8h光照/16h黑暗处理，温度为15℃黑暗/25℃光照，处理25-30d后，接种成功后的雄茭开始孕茭，孕茭20d后，剥去叶鞘，肉质茎内部为白色正常茭白。