[发明专利]一种高效生产(2S,3S)-2,3-丁二醇的基因工程菌及其构建方法与应用

说明书

本发明涉及一种高效生产(2S,3S)‑2,3‑丁二醇的基因工程菌及其构建方法与应用。本发明在大肠杆菌同时表达金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯氏菌中的2,3‑丁二醇脱氢酶，或者同时表达金黄色葡萄球菌和谷氨酸棒杆菌中的2,3‑丁二醇脱氢酶，或者同时表达肺炎克雷伯氏菌和谷氨酸棒杆菌中的2,3‑丁二醇脱氢酶，构建了新的基因工程菌，通过双酶协同作用，降低细胞内双乙酰的积累，强化双乙酰转化为(2S,3S)‑2,3‑丁二醇，从而提高底物浓度，提高底物转化率，进而实现了(2S,3S)‑2,3‑丁二醇产量的提升，达到了7.85g/L。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高效生产(2S,3S)-2,3-丁二醇的基因工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

2,3-丁二醇是分子式为(CH₃CHOH)₂的有机化合物，在常温下是一种无色无味的液体或者晶体。2,3-丁二醇拥有两个手性碳原子，因此它有三种立体异构体，分别是meso-2,3-丁二醇、(2S,3S)-2,3-丁二醇和(2R,3R)-2,3-丁二醇。并且2,3-丁二醇的三种立体异构体由于存在不同的手性基团而各自拥有不同的性质，这一特性使得光学纯2,3-丁二醇在不对称合成中备受关注。

2,3-丁二醇在航空燃料，医药，食品，化妆品等多个方面具有广泛的应用。具有光学活性的2,3-丁二醇在不对称合成有价值的手性化合物方面具有很好的应用前景。(2S,3S)-2,3-丁二醇可用于药物阿司匹林的关键中间体--对甲苯磺酸酯，其低凝固点(-60℃)的特性，使其可作为抗冻剂，并且它也是合成手性试剂和配体的重要前体物质。(2S,3S)-2,3-丁二醇还可用于电镀业中用作光亮剂，聚氨酯橡胶与纤维生产中的扩连剂，也用作溶剂和增湿剂，在制增塑剂、医药、聚酯树脂、聚氨基甲酸树脂等方面也具有广泛的应用。

现阶段生产单一构型2,3-丁二醇主要有生物法和化学合成方法。化学合成2,3-丁二醇的立体异构体选择性生产工艺复杂，控制困难，实施成本高。此外，通过化学路线生产的2,3-丁二醇的光学纯度相当低。所以生物技术路线已成为手性2,3-丁二醇的首选方法，但是大多数天然微生物发酵会产生两种不同构型的2,3-丁二醇并且天然微生物产生的2,3-丁二醇中(2S,3S)-2,3-丁二醇的占比通常较小，例如，克雷伯氏菌和肠杆菌属的菌株主要产(2S,3S)-2,3-丁二醇和meso-2,3-丁二醇，芽孢杆菌属主要生产(2R,3R)-2,3-丁二醇和meso-2,3-丁二醇，至今未发现产单一构型2,3-丁二醇的天然微生物。这是由于双乙酰的生成是由α-乙酰乳酸自发氧化脱羧产生，并且双乙酰浓度过高会对微生物正常生长代谢产生影响，因此在正常条件下双乙酰很难积累到较高的浓度，进而只能产生少量的(2S,3S)-2,3-丁二醇。

全细胞作为一种在有机合成中被广泛应用的生物催化剂，常应用于需要辅因子再生的合成反应比如还原酶催化的反应，只需在反应液中加入廉价的葡萄糖，就可达到细胞内部辅因子再生。此外，全细胞催化法产物分离较简单，具有工业化应用前景。并且，在单一构型(2S,3S)-2,3-丁二醇的生产中，菌株发酵时由于双乙酰对菌体生长代谢的抑制，菌株只能在非常低的双乙酰浓度下进行发酵，而在全细胞催化反应时细胞可以在较高浓度的双乙酰中进行反应。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种高效生产(2S,3S)-2,3-丁二醇的基因工程菌及其构建方法与应用。本发明将肺炎克雷伯氏菌，谷氨酸棒杆菌以及金黄色葡萄球菌中的2,3-丁二醇脱氢酶在大肠杆菌中表达，构建以双乙酰为底物的(2S,3S)-2,3-丁二醇代谢途径，从而实现以双乙酰为底物转化生产(2S,3S)-2,3-丁二醇。

本发明的技术方案如下：

一种高效生产(2S,3S)-2,3-丁二醇的基因工程菌，所述基因工程菌同时表达金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯氏菌中的2,3-丁二醇脱氢酶，或者同时表达金黄色葡萄球菌和谷氨酸棒杆菌中的2,3-丁二醇脱氢酶，或者同时表达肺炎克雷伯氏菌和谷氨酸棒杆菌中的2,3-丁二醇脱氢酶。