[发明专利]慢病毒纯化工艺

说明书

本发明涉及一种新的慢病毒纯化工艺，其包括以下步骤：（1）在慢病毒收获前，加入核酸酶进行消化，得到细胞培养液；（2）对细胞培养液进行澄清，得到澄清液；（3）对澄清液进行浓缩，得到浓缩液；（4）对浓缩液进行洗滤，得到纯化的慢病毒。本发明的慢病毒纯化工艺缩短了工艺步骤和工艺时间，提高了慢病毒滴度的回收率。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种慢病毒纯化工艺。

背景技术

慢病毒是由HIV-1（人类免疫缺陷病毒1型）改造而来的一种病毒载体。近年来，基因治疗和细胞治疗兴起，慢病毒由于其自身特性——既能感染分裂细胞又能感染非分裂细胞，能够容纳外源性大的基因片段，表达的持久性、免疫反应小等优点，在其中具有非常广阔的应用前景。慢病毒上游的生产工艺一般采用HEK293细胞进行瞬时转染或构建稳定生产细胞系的方式进行生产，细胞的培养方式可以分为贴壁培养和悬浮培养。慢病毒下游的生产工艺路线一般先通过澄清（离心或过滤）去除大的细胞、细胞碎片及部分杂质，然后通过超滤系统对病毒进行浓缩、溶液置换及部分杂质的去除，再经过核酸酶（一般为Benzonase）的消化去除部分残留核酸，最后通过二次超滤、层析等技术对慢病毒进一步进行纯化。已报道的病毒总回收率约为36%（参见例如专利文献1：CN112899242A）。目前慢病毒生产和纯化工艺仍面临一系列挑战，例如工艺流程复杂，工艺放大困难，病毒收获率低；生产稳定性差，批次间差异大，病毒感染能力不稳定；核酸、HCP（host cell protein，宿主蛋白）等杂质残留引起的免疫问题等。

发明内容

本申请发明人发现，现有慢病毒生产工艺依次包括收获、澄清、浓缩、洗滤、消化、进一步纯化，步骤繁琐，操作时间过长，容易导致慢病毒失活。如果为了避免失活而在低温下进行全部操作，则消化步骤中核酸酶活性降低，因而消化效果降低，只能通过延长消化时间或增加酶量的方式进行补偿，但这种方式在增加生产成本的同时还会对慢病毒活性和颗粒数造成损害。另一方面，如果选择在更适合核酸酶消化的37℃进行消化，则需要使病毒经历降温、升温、降温的三次温度升降转换，这样也会降低慢病毒的活性和颗粒数。且现有技术中层析压力较大，增加层析步骤会减少病毒回收，减少层析步骤会导致慢病毒质量不合格。

有鉴于此，本发明的目的是提供一种新的慢病毒纯化工艺，与现有工艺相比，本发明将慢病毒消化工艺与慢病毒上游生产工艺结合，在慢病毒收获的温度37℃下直接加入核酸酶进行消化，在保证核酸酶活性的同时，还减少了整个操作过程中的温度转换次数；并且，由于消化的提前，只需要一次洗滤就能够去除核酸酶及消化后的核酸片段，缩短了工艺步骤和工艺时间，进一步提高了慢病毒滴度的回收。

基于上述目的，本发明提供了一种慢病毒纯化工艺，其包括以下步骤：

（1）在慢病毒收获前，加入核酸酶进行消化，得到细胞培养液；

（2）对细胞培养液进行澄清，得到澄清液；

（3）对澄清液进行浓缩，得到浓缩液；

（4）对浓缩液进行洗滤，得到纯化的慢病毒。

在本发明的优选的实施方案中，在慢病毒收获前0.2-6 h、优选0.2-4 h、更优选0.5-2 h时，加入核酸酶。如果距离收获前的时间太短，则反应不充分，导致核酸残留；如果距离收获前的时间过长，核酸酶可能会过度反应，影响慢病毒的活性和滴度。

在本发明的优选的实施方案中，加入核酸酶至5-200 U/mL、优选至5-150 U/mL、更优选至10-100 U/mL。

在本发明的优选的实施方案中，在步骤（1）的消化处理中，为了提高核酸酶的活性，还加入Mg²⁺或Mn²⁺至0.5-20 mM、优选至0.5-15 mM、更优选至1-10 mM。