[发明专利]一种检测用大麻二酚标准物质的制备的方法

说明书

本发明提供了一种检测用大麻二酚标准物质的制备方法。选取酚类物质基因相对表达量为7.0以上的工业大麻叶片并制浆，取5.0g该叶片浆样品与100mL质量分数80％的甲醇溶液，置于三角瓶中超声处理，时间15min、功率149W，然后在0.09MPa、65℃条件下，减压蒸馏除甲醇后备用。选取枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌，制备复合直投式发酵剂。复合直投式发酵剂的添加量为发酵物料重量的0.01％，36℃静止发酵24h。发酵液经离心后取上清液经正己烷萃取后氮吹干燥，然后经甲醇溶解取上清液备用。制备表面均匀分布羟基的活化硅胶固相萃取柱，将上述上清液经固相萃取柱分离后,获得一种检测用大麻二酚标准品,经测定纯度范围为92.2％‑98.5％。

(一)技术领域

本发明涉及一种检测用大麻二酚标准物质的制备方法，具体涉及一种荧光定量PCR技术和一种生物发酵技术，结合固相萃取技术制备一种检测用大麻二酚标准物质，属生物和化学领域。

(二)背景技术

大麻是大麻科大麻属一年生草本植物，是我国传统经济作物，具有重要的工业及药用价值，在我国已有5000多年的栽培利用历史。大麻的产品利用涉及纺织、造纸、军需、化工、建材、食品及制药等多个方面。大麻素是大麻植株中特有的含烷基和单萜基团的次生代谢物。目前，自大麻植物中分离得到的大麻素有70多种，主要包括THC(tetrahydrocan-nabinol，四氢大麻酚)、CBD(cannabidiol，大麻二酚)、CBC(cannabichromene，大麻环萜酚)、CBN(cannabinol，大麻酚)、CBG(cannabigerol，大麻萜酚)及其丙基同系物THCV、CBDV、CBCV和CBGV等。其中的CBD是大麻中的非毒性和非成瘾性成分，能阻碍THC对人体神经系统的不利影响，是大麻酚类物质中最重要的生理活性成分之一，对于抗焦虑，镇痛、抗失眠、阿尔茨海默病和抗惊厥等有一疗效，并且具有治疗糖尿病、口腔疾病、风湿性疾病等生理活性功能，具有重要的临床应用前景。受遗传控制、生长环境和栽培条件影响，大麻CBD含量在个体之间存在差异，主要体现在大麻叶、种子和茎等部位中。研究发现大麻中CBD含量与大麻二酚酸合成酶基因(CBDAS)mRNA表达量之间呈正相关。目前大麻酚类物质含量的检测方法所用的标准物质均为化学合成，成本高、合成难度较大，限制了大麻酚类物质的检验，天然高纯度大麻酚类物质的制备尚属国内空白领域。

本发明利用荧光定量PCR，筛选CBD含量高的组织，采用生物发酵技术，将大麻中高分子纤维素水解后释放出大麻酚类物质，根据大麻二酚的分子量，制备COF修饰硅胶固定相，利用有机溶剂萃取，经色谱柱分离后获得一种纯度范围为92.2％-98.5％的检测用大麻二酚标准物质。该发明的实施填补了天然大麻二酚标准物质的制备的领域空白，实现我国对大麻酚类物质医药产品领域的初步突破。

(三)发明内容

本发明目的在于提供一种结合荧光定量PCR技术和生物发酵技术制备大麻二酚标准物质的方法。

本发明的目的是这样实现的：

1实验材料的选择

选取工业大麻叶片，液氮速冻，保存于－80℃。

1.1工业大麻叶片组织的RNA提取及反转录

提取工业大麻叶片的总RNA，浓度为415.6ng/μl，经DNase I消化处理后，反转录合成cDNA，反转录时体系中加入0.8μg RNA。并以此为模板进行荧光定量PCR反应。

1.2CBDAS的荧光定量PCR

以cDNA为模板进行荧光定量PCR反应，复孔重复三次。使用Primer Premier 5.0设计荧光定量PCR中CBDAS的引物为:

CBDAS F：5’－ATGAAGTGCTCAACATTCTTCT－3’

CBDAS R：5’－TTAATGACGATGCCGTGGAAG－3’

内参基因18S的引物为: