[发明专利]一种检测用大麻二酚标准物质的制备的方法

权利要求书

1.一种检测用大麻二酚标准物质的制备方法，其特征是：选取酚类物质基因相对表达量为7.0以上的工业大麻叶片并制浆，取5.0g该叶片浆样品与100mL质量分数80％的甲醇溶液，置于三角瓶中超声处理，时间15min、功率149W，然后在0.09MPa、65℃条件下，减压蒸馏除甲醇后备用，选取枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌，制备复合直投式发酵剂，复合直投式发酵剂的添加量为发酵物料重量的0.01％，36℃静止发酵24h，发酵液经离心后取上清液经正己烷萃取后氮吹干燥，然后经甲醇溶解取上清液备用，制备表面均匀分布羟基的活化硅胶固相萃取柱，将上述上清液经固相萃取柱分离后,获得一种检测用大麻二酚标准物质,经检测纯度范围为92.2％-98.5％。

2.根据权利要求1所述一种检测用大麻二酚标准物质的制备方法，其特征是：PCR反应体系和条件为：

反应体系：

SYBR Green，Mix和引物混合物配制:

Mix 10μl

Primer F+R 1μl

SYBR Green(16μl)96孔板配制：

Mix+引物 8μl

cDNA 8μl

反应条件：40个循环

溶解曲线：

60℃ 60s

95℃ 30s

60℃ 15s。

3.根据权利要求1所述一种检测用大麻二酚标准物质的制备方法，其特征是：直投式发酵剂采用这样方法制备：分别取10mL 0.9％的生理盐水于2只试管内，经121℃灭菌15分钟冷却至30℃，将2株菌安瓶内的冻干菌粉末在无菌状态下全部倒入0.9％的生理盐水中，震荡使其溶解，在30℃恒温箱中静止活化30分钟，备用；分别取200mL上述两种培养基于2只500mL三角瓶内，121℃灭菌15分钟冷却至30℃，按培养基体积的10％接种2.2.1步骤中已经活化的菌种，在36℃培养箱内静止培养24h，作为母发酵剂；分别取上述两种培养基，分装于2只500mL三角瓶内，每瓶200mL，121℃灭菌15分钟冷却至36℃，分别按2％体积比例接种母发酵剂，36℃培养24-28h，检测2株菌发酵液活菌数，各发酵液活菌数≥10⁹个/mL，视同为发酵成熟，如果活菌数＜10⁹个/mL，继续培养，直至达到10⁹个/mL；将成熟的生产发酵剂在无菌条件下导入玻璃安瓶中，液面高度低于1cm，加盖瓶塞后放入-30℃冰柜速冻，冻结后将玻璃安瓶用托盘乘装，放入冻干机进行冷冻干燥，制备粉末冻干菌种。

4.根据权利要求1所述一种检测用大麻二酚标准物质的制备方法，其特征是：微生物发酵法制备叶片浆水解液：将叶片浆按其重量的0.01％添加复合菌直投式发酵剂，充分溶解后，36℃保温静止发酵24h。

5.根据权利要求1所述一种检测用大麻二酚标准物质的制备方法，其特征是：活化硅胶采用这样方法制备：称取6.0g多孔硅胶浸入120ml盐酸/水(1:3＝v/v)，浸泡12h，在机械搅拌下回流24h除去金属离子，然后用G5砂芯漏斗过滤，用高纯水反复冲洗至中性，最后用丙酮洗涤两次，在70℃条件下真空干燥10h除去表面溶剂和水，即得到表面均匀分布羟基的活化硅胶。