[发明专利]一种永生化牦牛瘤胃上皮细胞系及其构建方法

说明书

本发明公开了一种永生化牦牛瘤胃上皮细胞系及其构建方法，所述细胞系保藏编号为：CCTCC NO. C2021245，分类命名为：永生化牦牛瘤胃上皮细胞系SV40T‑YREC‑hTERT。本发明将原代牦牛瘤胃上皮乳头Ⅰ型胶原酶消化后的组织贴壁培养出原代瘤胃上皮细胞，以此细胞为宿主细胞，用携带SV40T和hTERT基因的慢病毒感染细胞，经筛选扩大培养后获得永生化牦牛瘤胃上皮细胞系，该细胞系的建立解决了原代瘤胃上皮细胞培养难、传代次数有限的缺陷，丰富了牦牛源细胞系资源；它能稳定传代，可保持原代瘤胃上皮细胞的形态特征且功能正常，为研究瘤胃上皮营养消化吸收代谢，细胞信号通路机制等提供了有用的体外细胞模型。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种永生化牦牛瘤胃上皮细胞系及其构建方法。

背景技术

牦牛是世界上能够适应青藏高原地区特殊严酷自然环境的特有牛种，是当地牧民赖以生存的重要生活和生产资料，也是牧区脱贫致富的主要支柱产业。我国是世界上牦牛养殖大国，占世界牦牛养殖总量的92％以上，主要分布在我国的西藏、青海、四川、甘肃、云南和新疆等地。有关牦牛的遗传育种、营养与饲料、疫病防控等基础研究和应用基础研究，我国处于世界领先水平。迄今为止国内外对瘤胃的研究越来越多，瘤胃上皮细胞内的调控机制也备受关注。反刍动物在生理结构上不同于单胃动物的最大特点是反刍动物具有复胃结构，在复胃中瘤胃最重要。瘤胃上皮组织是瘤胃内环境与宿主机体环境的重要屏障，瘤胃上皮是瘤胃的主要部位，大量的上皮乳头从瘤胃表面伸入内腔，极大的增加了吸收挥发性脂肪酸和电解质的表面积，瘤胃上皮层吸收的营养物质是整个动物能量代谢不可或缺的。牦牛作为一种常年生活在青藏高原特殊地域环境中的优势畜种，其瘤胃代谢与其他反刍动物相比存在许多特异性。然而目前的研究中，牦牛瘤胃上皮细胞的研究较少并且稳定来源的瘤胃上皮细胞系还未建立，制约了对牦牛瘤胃上皮细胞相关的研究，使其相关领域的技术匮乏影响更多分子生物学领域的发展。目前牦牛来源的原代细胞或者细胞系匮乏，获得更多牦牛来源的细胞系丰富牦牛相关的细胞分子调控机制至关重要。

绝大多数正常细胞被认为仅有有限的分裂能力，在不能分裂后就进入衰老状态。此时细胞仍然是存活的，但细胞的基因和蛋白的表达谱发生了很大改变。衰老的细胞不能在一些常规的刺激下再诱导细胞分裂，并且衰老细胞的细胞周期分布也比较特殊，不同于一些损伤诱导的细胞休眠，也不同于细胞生长接触抑制的情况，衰老细胞通常体积变大。研究发现原代牦牛瘤胃上皮细胞在体外培养也出现无法长期传代保存，传代次数增加对原代细胞形态和生理功能有严重的损害作用。同时数量有限的分离组织，严重限制了外源营养物质在细胞水平上的分子表达机制。

公开号为CN107881197A的中国专利公开了一种永生化奶牛瘤胃上皮细胞系及其构建方法，所述构建方法包括如下步骤：步骤a)将采集到的奶牛瘤胃上皮组织在培养基中剪碎清洗消化后进行原代培养，得到瘤胃上皮细胞；步骤b)将步骤a)所述的瘤胃上皮细胞与携带SV40T抗原基因的病毒液进行孵育得到感染的瘤胃上皮细胞；步骤c)将步骤b)感染的瘤胃上皮细胞进一步培养得到永生化的奶牛瘤胃上皮细胞系。虽然本发明的永生化奶牛瘤胃上皮细胞系为奶牛瘤胃生理调控和营养吸收机制研究提供试验细胞模型，培养方法简单、生长速度快，本发明的构建方法可获得具有生理功能且能连续传代的BRECs，但是由于奶牛和牦牛物种的显著差异，导致该方法培养不出永生化的牦牛瘤胃上皮细胞系。经检索，关于永生化牦牛瘤胃上皮细胞系的建立至今未有见报道。因此迫切需要建立一株能够稳定传代的永生化牦牛瘤胃上皮细胞系，对牦牛的基础研究有着重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种细胞系功能完整，能维持牦牛瘤胃上皮细胞原有特性的永生化牦牛瘤胃上皮细胞系；

本发明的另一目的在于提供一种操作方法简单、永生化成功率高的构建永生化牦牛瘤胃上皮细胞系的方法。