[发明专利]高等植物ACS双酶活关键位点突变制备单酶活突变体及应用

说明书

本发明适用于基因工程技术领域，提供了高等植物ACS双酶活关键位点突变制备单酶活突变体，ACS单酶活性关键位点包括保守域BOX2保守序列F‑Q‑D‑Y‑H‑G‑[LM]‑[PSKL]中的Q位点和保守域BOX4保守序列T‑N‑P‑S‑N‑P‑L‑G‑[TA]‑[TAMVIF]中的[TA]‑[TAMVIF]位点，以及C‑S裂解酶单酶活性关键位点，包括保守域ACS‑motif 5保守序列D‑F‑x(3)‑K‑N‑I‑H‑L‑[IV]‑S‑D‑E‑I‑[YF]‑[SA]‑G‑[TS]‑V‑F中的第13个氨基酸D。在拟南芥ACS7蛋白中，根据其在所有编码氨基酸中的位置，上述位点分别对应Q98、A221和T222，以及D245位点。将上述位点突变为其他氨基酸，会导致突变后的ACS蛋白只具有ACS或C‑S裂解酶单酶活性。本发明为利用基因工程方法控制乙烯参与的多项生命过程如果实成熟等提供了关键靶点，在抗逆作物分子育种中也具有广阔的应用前景和重要的经济价值。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及高等植物ACS双酶活关键位点突变制备单酶活突变体与应用。

背景技术

作为重要的植物激素之一，乙烯对高等植物生长发育的诸多方面，包括种子萌发、细胞伸长、根系发育、叶片伸展、开花与果实成熟、器官衰老与脱落等都起着重要的调节作用。同时，乙烯在植物对生物与非生物逆境响应与抵抗过程中的作用也不可或缺。在种子植物中，乙烯的生物合成主要经过三步重要的催化反应：第一步，甲硫氨酸在S-腺苷甲硫氨酸合酶的作用下生成S-腺苷甲硫氨酸(SAM)；第二步，SAM在1-氨基环丙烷-1-羧酸合酶的催化下发生γ位的C-S健断裂和α，γ位C-C环化生成1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)，第三步，5′-甲硫腺苷(MTA)、ACC在ACC氧化酶(ACC oxidase，ACO)的作用下转化为乙烯。其中，ACS催化SAM形成ACC是高等植物乙烯合成的限速步骤，ACS也被称为乙烯合成的限速酶。

高等植物的ACS由多基因家族编码，其成员的氨基酸序列都包含一个保守的AAT-like(Aspartate aminotransferases-like)结构域，属于磷酸吡哆醛(Pyridoxal-5’-Phosphate，PLP)依赖型蛋白酶的α超家族(superfamily)，。除ACS外，这个家族的其他亚族还包括氨基转移酶和C-S裂解酶等。模式植物拟南芥的ACS家族成员共有12个，其中ACS1-2，ACS4-9和ACS11编码乙烯合成关键酶ACS，ACS10和ACS12编码以天冬氨酸和芳香族氨基酸为底物的氨基转移酶，而ACS3是一个没有功能的假基因。高等植物ACS蛋白的保守域有7个，分别被命名为BOX1至BOX7。长期以来，人们一直一致认为乙烯合成关键酶ACS是单酶，只能催化SAM形成ACC，参与植物体内乙烯的生物合成，主要作用于果实成熟、器官衰老等发育过程。但是，申请人发现，高等植物中的乙烯合成关键酶ACS，包括拟南芥AtACS7，除了具有传统认知的ACS活性外，还能以胱氨酸为底物催化生成铵根离子和丙酮酸(图1)，表明其也具有C-S裂解酶活性。丙酮酸是糖酵解的终产物和线粒体三羧酸循环的能量底物，是维持呼吸代谢的非常重要的代谢物，在植物抵抗多种逆境胁迫中发挥重要作用。高等植物ACS蛋白双酶活性的发现，使之成为促进植物发育、果实成熟以及抵抗逆境抗性两种不同而又紧密关联的生命过程的关键交叉点，对其双酶活性的平衡和调控是利用生物技术手段进行作物改造的重要靶标。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供高等植物ACS蛋白ACS和C-S裂解酶单酶活性的关键位点及其应用，旨在提供一种通过对双酶活性的平衡和调控的生物技术手段进行作物改造的方法。