[发明专利]一种基于改良型DO-stat策略调控毕赤酵母表达外源蛋白的方法

说明书

本发明提供了一种基于改良型DO‑stat策略调控毕赤酵母表达外源蛋白的方法，所述方法包括当Mut⁺型重组毕赤酵母进入甲醇流加诱导阶段时，采用在线指数和DO‑stat相结合策略进行甲醇流加控制，以将DO的震荡宽度范围控制在10‑30％，甲醇浓度控制在0‑2g/L。采用本发明的方法，胞内的有毒的代谢物(甲醇和甲醛)维持在了零水平；且甲醇消耗/流加速度被明显提高了。

技术领域

本发明涉及发酵工程技术领域，尤其涉及一种基于改良型DO-stat策略调控毕赤酵母表达外源蛋白的方法。

背景技术

人粒细胞集落刺激因子(hGCSF)是一种造血细胞因子，作用于中性粒细胞谱系的细胞，能引起定向前体细胞的增殖和分化，并激活成熟中性粒细胞。由于其低分子量(18.8kDa)的特性，hGCSF可快速从血浆中清除，半衰期(t_1/2)极短，仅为4-8小时。为了解决这一问题，构建了重组毕赤酵母生产人血清白蛋白人粒细胞集落刺激因子(HSA-GCSF^m)融合蛋白的组成型表达载体，其具有较强的生物活性和较长的体内半衰期。但是，与HSA-GCSF^m融合蛋白生产过程优化的相关文献报道较少。

甲醇营养型毕赤酵母是一种表达外源蛋白的理想型的宿主。一般而言，重组毕赤酵母表达外源蛋白主要分成两个阶段：1)在细胞生长阶段，以甘油为唯一碳源在短时间内获得高密度的骨架完整、功能健全的细胞；2)在甲醇诱导阶段，通过流加甲醇诱导重组蛋白的高效表达。众所周知，甲醇诱导阶段的时间(70-90h)远长于细胞生长阶段(20-30h)。因此，开发一种有效的甲醇流加策略被认为是提高外源蛋白表达的关键问题。大量的甲醇流加策略已经被开发并应用于外源蛋白的高效表达，例如定速流加甲醇，甲醇ON-OFF流加和DO-stat流加甲醇等。在上述的甲醇流加策略中，在线DO-stat和ON-OFF反馈控制策略被认为优于其他控制策略，因为其在甲醇流加过程中可在线处理发酵过程参数的动态变化[CosO,Ramón R,Montesinos JL,et al.Microb Cell Fact,2006,5:17]。然而，传统的DO-stat流加策略通过在线测量的DO水平控制底物流加且(或)基于DO的持续震荡流加底物，这往往会导致碳源(甲醇)的匮乏[Jia LQ,Li T,Wu YX,et al.Appl.Microbiol.Biotechnol,2021,105:1041-1050]。具体地说，采用DO-stat流加策略时，毕赤酵母细胞对于甲醇的需求超出了甲醇的流加量，这意味着毕赤酵母细胞消耗甲醇受到了限制。另一方面，当采用ON-OFF控制策略时，甲醇浓度被控制在4-10g/L的充足水平会导致胞内有毒代谢物的积累[GaoMJ,Shi ZP.Chin J Chem Eng,2013,21:216-226]。因此，细胞处于甲醇过剩(ON-OFF控制)和匮乏(DO-stat控制)的状态必须被考虑和解决。

发明内容

本发明旨在解决现有技术中存在的技术问题。为此，本发明提供一种基于改良型DO-stat策略调控毕赤酵母表达外源蛋白的方法，目的是提高甲醇消耗率和外源蛋白的表达，也可为毕赤酵母表达外源蛋白的过程控制提供一些有价值的信息。

基于上述目的，本发明提供了一种基于改良型DO-stat策略调控毕赤酵母表达外源蛋白的方法，所述方法包括当Mut⁺型重组毕赤酵母进入甲醇流加诱导阶段时，采用在线指数和DO-stat相结合策略进行甲醇流加控制，以将DO的震荡宽度范围控制在10-30％，甲醇浓度控制在0-2g/L。

作为一种优选的实施方式，所述在线指数和DO-stat相结合策略进行甲醇流加控制，此方法将DO的震荡宽度控制在了狭窄且稳定的水平(～20％)，甲醇浓度在0-1g/L。

作为一种优选的实施方式，所述在线指数和DO-stat相结合策略是通过基于溶解氧电极在线监测溶解氧浓度进行调控甲醇流加速度的调控方法得到的。