[发明专利]一种微滴式数字PCR高浓度检测方法

说明书

本申请公开了一种微滴式数字PCR高浓度检测方法，包括：识别原始液滴灰度图像中的液滴位置；选择液滴局部分析区，分别计算液滴局部分析区对应的灰度概率密度直方图和半径概率密度直方图；通过矩守恒阈值法分别计算液滴局部分析区对应的像素阈值和半径阈值；根据像素阈值和半径阈值，对液滴进行第一次阳性点筛选；选取液滴限定分析区，对液滴进行第二次阳性点筛选，并更新认定为阳性的液滴的阈值；计算所有液滴的平均阈值，利用更新后的液滴的阈值和平均阈值，更新液滴的灰度值；生成液滴灰度直方图，获取液滴阴性和阳性划分的阈值，重新划分液滴阴性和阳性。该方法可以提高微滴式数字PCR检测浓度，扩大浓度动态范围。

技术领域

本发明涉及图像处理技术领域，特别是涉及一种微滴式数字PCR高浓度检测方法。

背景技术

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是一种生物体外实现特定DNA片段扩增的技术。数字PCR基于聚合酶链式反应的原理精确的测定基因拷贝数，实现对基因突变定性和定量分析。微滴式数字PCR系统是用油水两相间隔得到的液滴当作微反应单元，将DNA或RNA样本稀释并分散成数万甚至数百万个独立的反应单元，每个反应单元中包含(或不包含)1个或1个以上目标分子(DNA或RNA模板)。微反应单元单层平铺于芯片内，将芯片放入升降温系统，针对所有的微反应单元的靶序列进行分子模板PCR扩增，扩增过程中微反应单元的荧光强度不断增强，完成扩增后，CCD或者CMOS相机在光学成像系统中采集用于特定基因片段标记的荧光探针信号，依据荧光信号强弱判断微反应单元的阳性或阴性，最终基于统计学分析(泊松分布)检测样本中核苷酸的浓度。数字PCR不依赖扩增曲线的循环阈值，不受扩增效率的影响，能够直接读出DNA分子的个数，是一种核酸分子绝对定量技术。

但是，在大视场的光路系统中，球面透镜中心区域透镜率高，距离中心越远透镜率越低，导致光路不均一现象，降低了样本的最高检测浓度，且透镜制作工艺复杂，特定波段的滤光片成品率低。试剂浓度、芯片材质、液滴大小、液滴融合、液滴点随机分布等因素影响液滴荧光值的强弱，导致阳性液滴的误检和漏检。随着阳性数量增大(即浓度增大)，阳性液滴的误检和漏检的现象会更加严重，数字PCR定量和定性的分析误差会增大。在扩增过程中，芯片可能出现局部加热不均一，导致真实微反应孔的荧光值偏弱，随着阳性数量增大(即浓度增大)，阴性荧光值与阳性荧光值的直方图分布会出现一个峰值，不能形成阈值划分的峰谷，导致阳性和阴性的阈值选择有误。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种微滴式数字PCR高浓度检测方法，可以减少光路不均一对图片的影响，提高微滴式数字PCR检测浓度，扩大微滴式数字PCR浓度动态范围。其具体方案如下：

一种微滴式数字PCR高浓度检测方法，包括：

获取不同曝光时间、不同浓度梯度的原始液滴灰度图像，识别所述原始液滴灰度图像中的液滴位置；

以任一液滴位置为中心，以设定的局部分析范围值为半径，选择液滴局部分析区，分别计算所述液滴局部分析区对应的灰度概率密度直方图和半径概率密度直方图；

利用所述灰度概率密度直方图和半径概率密度直方图，通过矩守恒阈值法分别计算所述液滴局部分析区对应的像素阈值和半径阈值；

根据计算得到的所述像素阈值和所述半径阈值，对液滴进行第一次阳性点筛选；

以被暂定为阴性的液滴的位置为中心，以设定的限定分析范围值为半径，选取液滴限定分析区，对液滴进行第二次阳性点筛选，并更新认定为阳性的液滴的阈值；所述限定分析范围值小于所述局部分析范围值；

计算所有液滴的平均阈值，利用所述更新后的液滴的阈值和计算的所述平均阈值，更新液滴的灰度值；

根据更新后的液滴的灰度值，生成液滴灰度直方图，在生成的所述液滴灰度直方图上获取液滴阴性和阳性划分的阈值，并根据获取的阈值重新划分液滴阴性和阳性。