[发明专利]一种免疫逃逸CD47过表达外泌体的构建方法

说明书

本发明公开了一种免疫逃逸CD47过表达外泌体的制备方法，包括(1)构建CD47过表达质粒，并包装到慢病毒中形成CD47过表达慢病毒；(2)将此慢病毒转染大鼠脂肪间充质干细胞(ADMSC)构建稳定的CD47过表达细胞株(CD47‑ADMSC)；(3)分离并纯化第五代CD47‑ADMSC来源的CD47‑ES，即获得具有免疫逃逸潜能的CD47过表达外泌体。利用本方法成功构建的CD47‑ES表达量是普通ADMSC外泌体(ADMSC‑ES)的1.7倍，且CD47‑ES在大鼠体内的滞留量(即免疫逃逸量)高于ADMSC‑ES，约为ADMSC‑ES的1.377倍，因此利用本方法构建的CD47‑ES具有较强的免疫逃逸能力，能延长其作为药物载体在动物体内发挥功能的时间。

技术领域

本发明涉及药物载体制备领域，尤其涉及一种具有免疫逃逸能力的CD47过表达外泌体的构建方法。

背景技术

外泌体(exosome，ES)是天然的纳米级药物载体，近年来是医学及生命科学领域的研究热点之一。外泌体具有相对稳定、体积小和储存时间长等优点，其内携带的RNA和蛋白质等活性物质在参与细胞间信号传导和细胞自我保护等过程中发挥重要作用。如Alvarez-Erviti 等人通过电穿孔等方式将药物与外泌体结合形成工程化外泌体来治疗疾病，其他文献也表明外泌体可作为药物载体应用在组织损伤修复及慢性疾病治疗中。但现有的工程化外泌体容易被吞噬细胞吞噬，不具备免疫逃逸能力，在作为药物载体应用时其效果将受到限制。

免疫逃逸是指细菌、病毒等外来物或肿瘤细胞逃脱免疫系统的识别与攻击，目前所发现的相关机制一般包括抗原性的变化、持续性感染及免疫抑制。而CD47是一种广泛存在于多种细胞的跨膜糖蛋白，具有免疫球蛋白可变的N端结构域、5个跨膜结构域和1个短的C端胞内尾，胞内尾含有4种可变剪切异构体，从而形成4个亚型。CD47是SIRPα的配体，不仅参与多种免疫细胞的吞噬及跨膜迁移，且同时参与多种免疫生理过程，如诱导淋巴细胞的凋亡及抑制单核细胞释放细胞因子。因此有必要研究出一种具有免疫逃逸能力的CD47过表达外泌体的构建方法。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种具有免疫逃逸能力的CD47过表达外泌体的构建方法，解决现有技术存在的外泌体逃逸能力不足的问题。

本发明提供了一种免疫逃逸CD47过表达外泌体的制备方法，包括以下步骤：(1)构建CD47过表达质粒，并包装到慢病毒中形成CD47过表达慢病毒；(2)将步骤(1)的CD47 过表达慢病毒转染大鼠ADMSC构建稳定的CD47过表达细胞株，(3)分离并纯化第五代 CD47-ADMSC细胞株来源的CD47-ES外泌体。

优选地，大鼠ADMSC浓度为1×10⁵个细胞/孔，培养20h，然后加入筛选培养基和CD47 过表达慢病毒，培养1天后更换为ADMSC完全培养基继续培养。

优选地，步骤(2)中，筛选培养基为加入2mL含有6μg/mL嘌呤霉素的ADMSC完全培养基，ADMSC完全培养基为450mL DMEM+50mL FBS+5mL P/S。

优选地，步骤(2)中，感染时CD47过表达慢病毒与ADMSC的数量比值为50：1。