[发明专利]一种免疫逃逸CD47过表达外泌体的构建方法

权利要求书

1.一种免疫逃逸CD47过表达外泌体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：(1)构建CD47过表达质粒，并包装到慢病毒中形成CD47过表达慢病毒；(2)将步骤(1)的CD47过表达慢病毒转染大鼠ADMSC构建稳定的CD47过表达细胞株；(3)分离并纯化第五代CD47-ADMSC细胞株来源的CD47-ES外泌体。

2.根据权利要求1所述的一种免疫逃逸CD47过表达外泌体的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，大鼠ADMSC浓度为1×10⁵个细胞/孔，培养20h，然后加入筛选培养基和CD47过表达慢病毒，培养1天后更换为ADMSC完全培养基继续培养。

3.根据权利要求1所述的一种免疫逃逸CD47过表达外泌体的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，筛选培养基为加入2mL浓度为6μg/mL嘌呤霉素的ADMSC完全培养基，ADMSC完全培养基为450mL DMEM+50mL FBS+5mL P/S。

4.根据权利要求1所述的一种免疫逃逸CD47过表达外泌体的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，感染时CD47过表达慢病毒与ADMSC的数量比值为50：1。

5.根据权利要求1所述的一种免疫逃逸CD47过表达外泌体的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，取第5代CD47-ADMSC，培养至85％的细胞聚合后，更换为无血清培养基继续培养3天；收集细胞培养基，将离心机设置为300xg，4℃离心10min，去除活细胞；2,000xg，4℃离心10min，去除死细胞；10,000xg，4℃离心30min，去除细胞碎片；用0.22μm过滤器过滤上清液；将滤液加到超滤管上层，5000xg，4℃，离心30min，重复此步3次；将超滤管中的上层液体加入超高速离心管，100000xg，4℃，超高速离心70min；倒掉管中液体，用巴氏吸管吸取PBS反复吹打管壁，获得CD47-ES并在-80℃保存备用。

6.根据权利要求1所述的一种免疫逃逸CD47过表达外泌体的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，将293T细胞培养至布满T75培养瓶，消化后用完全培养基调整细胞数量至3.5×10⁵个/mL，转移至10cm细胞培养皿中培养24h后，将培养基更换为无血清培养基；取离心管依次加入20μg CD47过表达质粒、15μg pHelper1.0载体质粒、10μg pHelper 2.0载体质粒和1mL吉凯转染试剂，混合均匀后室温静置15min；将上述溶液滴入培养基培养6h，弃培养基，加入15mL PBS晃动洗净，倒掉PBS，加入20mL完全培养基培养72h，浓缩并纯化后获得CD47过表达慢病毒载体。