[发明专利]单个抗原特异性转基因杂交瘤细胞筛选方法

说明书

本发明公开了单个抗原特异性转基因杂交瘤细胞筛选方法，通过制备表达EGF‑R‑AVI‑tag融合蛋白的转基因Sp2/0骨髓瘤细胞，结合传统杂交瘤技术的脾细胞融合技术，获得可在细胞膜展示分泌型特异性抗体的转基因杂交瘤细胞，并利用单细胞分选系统实现对单个特异性转基因杂交瘤细胞的筛选。本发明基于转基因技术，提供一种精准、高通量的转基因杂交瘤单克隆抗体生产平台。与传统杂交瘤技术相比，显著缩短了单个抗原特异性杂交瘤细胞的制备时间和成本，提高了单细胞率和阳性率，且制备的单克隆抗体的效价和亲和力也显著提高。本发明提供的转基因杂交瘤抗体制备技术可用于制备高特异性、高灵敏度和高稳定性稀有单克隆抗体，应用前景广阔。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及单个抗原特异性转基因杂交瘤细胞筛选方法。

背景技术

单克隆抗体(Monoclonal antibody,mAb)广泛应用于生物学、医学、环境检测和食品科学等领域。近年来，噬菌体展示技术和单个B细胞技术为单克隆抗体的发展提供了广阔的空间，但这些方法仍处于初级阶段，对于抗体的广泛制备还具有一定的局限性。因此，传统杂交瘤技术仍然是目前制备单克隆抗体最主要的方法。在传统杂交瘤技术中，有限稀释法筛选抗原特异性的杂交瘤细胞耗时、耗力且效率低，同时在杂交瘤细胞早期，抗体分泌量极低，很难实现高效准确的检测。因此抗原特异性杂交瘤细胞的高效筛选选尤为重要。

近年来，基于膜受体的流式细胞分选技术(FACS)广泛应用于抗原特异性杂交瘤细胞的筛选。由于杂交瘤细胞表面缺少抗原结合受体，导致筛选过程中较高假阳性的出现。为了实现杂交瘤细胞表面抗体的展示，从而提高抗原特异性杂交瘤细胞筛选的精准度，降低假阳性。通过化学共价修饰法，在杂交瘤细胞膜表面偶联脂肪链(Oleyl-PEG4000-NHS)，实现了杂交瘤细胞表面抗体的展示，显著提高了抗原特异性杂交瘤细胞的筛选效率。但细胞表面偶联的脂肪链很不稳定，会随着杂交瘤细胞分裂而丢失，且化学共价修饰对杂交瘤细胞的正常功能和活力也会造成不可逆的损伤。表皮细胞生长因子受体(EGF-R)是一个跨膜糖蛋白，通过融合表达技术，其跨膜区蛋白广泛应用于细胞膜表面外源蛋白的展示。

抗原特异性抗体展示在转基因杂交瘤表面，可以实现对抗体结合性能和表达水平的快速鉴定和准确分析，从而完成对分泌能力强且抗体亲和力较高的转基因杂交瘤细胞的精准鉴定。

因此开发一种高通量、自动化和精确的单个抗原特异性杂交瘤细胞筛选及抗体制备技术尤为重要。

发明内容

本发明的目的是提供单个抗原特异性转基因杂交瘤细胞筛选方法。

本发明构思如下：本发明基于PiggyBac转座酶将EGF-R的跨膜区与生物素受体肽AVI-tag稳定整合到杂交瘤细胞基因组中，实现EGF-R-AVI-tag融合蛋白在转基因杂交瘤细胞表面的稳定表达，通过生物素连接酶偶联链霉素修饰的抗原，实现分泌型抗体的捕获，从而达到抗原特异性抗体在杂交瘤细胞细胞表面的展示，为抗原特异性杂交瘤细胞的高效精准筛选奠定基础。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供单个抗原特异性转基因杂交瘤细胞筛选方法，所述方法包括：制备表达EGF-R-AVI-tag融合蛋白的转基因Sp2/0骨髓瘤细胞，结合传统杂交瘤技术的脾细胞融合技术，获得可在细胞膜展示分泌型特异性抗体的杂交瘤细胞，并利用单细胞分选系统(如CellenONE全自动单细胞分选系统)实现对单个特异性转基因杂交瘤细胞的筛选。

所述EGF-R-AVI-tag融合蛋白为：

(a)由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)SEQ ID NO:1所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白质。

前述的方法，编码EGF-R-AVI-tag融合蛋白的核酸序列通过质粒导入Sp2/0骨髓瘤细胞，或通过基因工程手段整合到Sp2/0骨髓瘤细胞的基因组中。